摘 要 熊果酸（UA）和齊墩果酸（OA）廣泛存在于蔬菜、水果和中藥材中，是生物活性廣而又低毒的天然化合物。體外實驗證明，UA和OA通過誘導癌細胞凋亡和壞死抑制胃癌、腸癌、肝癌等消化系腫瘤細胞增殖。UA和OA還有抗誘變、抗促癌和增強機體免疫作用。因此，UA和OA有望成為臨床防治消化系腫瘤的藥物。

關鍵詞 熊果酸 齊墩果酸 抗腫瘤作用

中圖分類號：R979.1；R285.6 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1533(2011)12-0606-06

熊果酸（ursolic acid，UA）是化學結構類似于甘草次酸（即甘草酸的苷元）的五環(huán)三萜類天然化合物，齊墩果酸（oleanolic acid，OA）是化學結構十分類似于UA的同分異構體。兩者廣泛存在于植物中，并像甘草酸那樣具有廣泛的生物活性，如保肝、抗炎、抗變態(tài)反應、抗病毒、抗菌和抗腫瘤作用[1～4]等。本文僅綜述UA和OA抗消化系腫瘤的藥理作用。

1 抗胃癌作用

UA濃度和時間依賴性抑制人胃癌BGC-823細胞增殖，處理12、24、36和48 h時的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為59、43、38和32 μM。在UA作用下，BGC-823細胞核體積變小、皺縮，其染色體呈濃染的塊狀和顆粒狀，聚集于核周邊或裂解成碎片，并出現(xiàn)凋亡小體，瓊脂糖凝膠電泳可呈現(xiàn)DNA凋亡梯帶。流式細胞儀分析發(fā)現(xiàn)，UA濃度依賴性提高細胞亞G1峰（細胞凋亡率），G1期細胞數(shù)下降，細胞周期滯留在S期。蛋白印跡檢測發(fā)現(xiàn)，UA濃度依賴性下調BGC-823細胞內凋亡抑制蛋白Bcl-2表達，促進線粒體釋放細胞色素C，下調生存素（survivin）表達，從而激活下游的半胱天冬酶-3活性；UA也濃度依賴性激活半胱天冬酶-8活性，從而也激活下游的半胱天冬酶-3，引發(fā)癌細胞凋亡[5，6]。

UA也濃度和時間依賴性抑制人胃癌SGC-7901細胞增殖，作用12、24、36和48 h時的IC50分別為58、34、28和25 μM。SGC-7901細胞漂起，變圓、腫脹或縮小，染色質濃縮、斷裂，凋亡小體形成。UA也濃度依賴性提高SGC-7901細胞凋亡率，但與對BGC-823細胞不同，UA使S期細胞數(shù)下降，細胞周期滯留在G0/G1期。機制研究發(fā)現(xiàn)，UA濃度依賴性抑制SGC-7901細胞內環(huán)氧化酶-2（COX-2）表達，減少前列腺素E2的生物合成，進而下調Bcl-2表達，促進腫瘤細胞凋亡[7，8]。UA還可通過抑制細胞外信號調節(jié)激酶及下游的周期素D1表達，抑制人胃癌MGC-803細胞增殖[9]。

2 抗腸癌作用

日本學者1992年報告，給大鼠喂飼含0.02% OA飼料能輕度預防氧化偶氮甲烷誘發(fā)腸腺癌，使對照組腸腺癌74%（20/27）的發(fā)生率及平均腫瘤數(shù)1.07±0.87分別降為52%（15/29）和0.66±0.72[10]。給大鼠每周5次灌服OA、UA或OA和UA混合物共4周，都能顯著降低1，2-二甲基肼誘導大鼠結腸產生異常隱窩灶（結腸癌早期）的發(fā)生率，顯示有預防結腸癌發(fā)生能力[11]。給大鼠喂含0.11% UA飼料明顯降低氧化偶氮甲烷誘導的啟動期大鼠結腸異常隱窩灶發(fā)生率，但對促進期和進行期大鼠的異常隱窩灶發(fā)生率無顯著影響。由于UA顯著提高正常和氧化偶氮甲烷處理組大鼠的結腸中性鞘磷脂酶活性、輕度提高酸性鞘磷脂酶活性，推測UA是通過促進鞘磷脂水解將結腸癌防止在啟動期的[12]。

用OA或UA 60 μM與人結直腸癌HCT15細胞體外培養(yǎng)24～72 h，死亡細胞數(shù)和細胞碎片數(shù)增加，大多數(shù)細胞死于72 h內。UA的腫瘤細胞毒作用強于OA，IC50分別為30和60 μM。用30 μM的UA或OA處理HCT15細胞78 h，大量細胞變性，但細胞碎片罕見。用流式細胞儀分析發(fā)現(xiàn)，UA 30 μM或OA 60 μM處理36和72 h，HCT15細胞逐漸累積在G0/G1期，而S期細胞數(shù)相應減少，沒有檢測到凋亡細胞。因此，兩藥可能是通過阻滯細胞周期而抑制腫瘤細胞增殖的[13]。表齊墩果酸和氧代齊墩果酸也能抑制HCT15細胞增殖[14]。OA抗人結腸癌HT-29細胞增殖的IC50為161 μM，濃度≥250 μM時有中度細胞毒作用，但不激活細胞凋亡蛋白（半胱天冬酶-3），也不誘導線粒體中活性氧（起前凋亡信號作用）生成，推測主要通過使結腸癌細胞壞死產生抗癌作用的[15]。

早在1988年就測得UA抑制人結腸癌HCT-8細胞增殖的IC50為4.5 mg/L。UA選擇性增強人結腸癌HT-29細胞中的堿性鞘磷脂酶活性，進而激活半胱天冬酶、誘導凋亡而抑制結腸癌細胞增殖[16]。我國研究發(fā)現(xiàn)，UA（10～50 μM）濃度和時間依賴性抑制HT-29細胞增殖并誘導凋亡，處理24、48和72 h時的IC50分別為26、20和18 μM。UA使癌細胞間隙增寬，胞內顆粒增多，出現(xiàn)空泡并漂浮于培養(yǎng)液，繼后出現(xiàn)細胞核固縮斷裂，核膜消失，細胞膜突起，凋亡小體形成，使細胞周期滯留在G0/G1期，S期細胞減少，并檢測到亞G1峰。推測UA是通過抑制表皮生長因子受體/絲裂原激活蛋白激酶（EGFR/MAPK）通路、上調HT-29細胞內半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-9表達、下調Bcl-2和Bcl-xL表達而誘導細胞凋亡的。但由于UA也使HT-29細胞壞死并出現(xiàn)細胞碎片，故認為UA也通過細胞毒作用殺傷腫瘤細胞[17～19]。UA可通過抑制蛋白激酶B的磷酸化，抑制BRAF突變的人結直腸癌CO115細胞增殖并誘導凋亡[20]。

3 抗肝癌作用

體外實驗發(fā)現(xiàn)，UA濃度和時間依賴性促進人肝細胞癌HepG2細胞和耐藥株R-HepG2細胞凋亡，抑制癌細胞增殖，但對原代培養(yǎng)的正常小鼠肝細胞無抑制增殖作用。抑制HepG2細胞增殖的IC50為20 μM。HepG2細胞主要被滯留在G0/G1期，并伴S期細胞數(shù)減少，引起DNA斷裂，產生亞二倍體，增加細胞色素C釋放，增強半胱天冬酶-3的激活。也見顯著抑制SV40 DNA復制的啟動、拓撲異構酶I的DNA裂解和復制蛋白A的單鏈DNA結合活性，增強細胞周期調節(jié)因子p21 WAF1表達。UA還能激活半胱天冬酶-8，減少抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL表達，但不影響前凋亡蛋白Bax和Bak表達，使多聚ADP核糖多聚酶裂解，下調環(huán)氧化酶-2蛋白和上調熱休克蛋白105 mRNA表達[21～23]。Yang等[24]最近報道，UA能活化Bak，也能通過與半胱天冬酶無關的凋亡誘導因子(AIF)信號通路（促進AIF的核易位）誘導耐藥株R-HepG2細胞凋亡。整體實驗也顯示，UA顯著抑制耐藥株R-HepG2細胞在裸鼠體內生長，明顯對抗癌細胞損傷肝、心、脾臟。因此，UA是通過外在的和內在的兩條凋亡通路引起HepG2細胞凋亡和細胞周期終止的。

UA濃度和時間依賴性顯著抑制人肝細胞癌SMMC-7721細胞增殖，誘導癌細胞周期終止和凋亡。機制研究發(fā)現(xiàn)，UA上調凋亡蛋白p53和Bax表達及GDF15、SOD2、ATF3的mRNA表達，下調抗凋亡蛋白Bcl-2和fos的mRNA表達，提示UA可能是通過激活p53通路抑制SMMC-7721細胞生長和誘導凋亡的[25]。有人用正常成纖維細胞與ras癌基因轉形的R6成纖維細胞或人肝細胞癌SMMC-7721細胞一起培養(yǎng)的實驗方法發(fā)現(xiàn)，OA能在對正常成纖維細胞無毒濃度下顯著抑制癌細胞生長，而UA無此種抑制作用。跨池（transwell）實驗發(fā)現(xiàn)，OA的這種抗癌作用并不需要正常細胞與癌細胞直接接觸。用OA處理正常成纖維細胞后的培養(yǎng)基進行實驗發(fā)現(xiàn)，OA能使正常細胞分泌具有抗癌作用的抑制因子[26]。

OA和UA誘導人肝細胞癌HuH7細胞凋亡，抑制生長的IC50分別為100和75 μM。隨著OA和UA濃度增加，HuH7細胞的亞G1期百分數(shù)相應提高。機制研究認為，OA和UA是通過促使線粒體中細胞色素C釋放到胞液，導致半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-3活化并誘導多聚ADP核糖多聚酶裂解，同時通過抑制核因子-κB活性和下調凋亡蛋白的X-連鎖抑制因子(XIAP)而誘導HuH7細胞凋亡的[27]。UA抑制小鼠肝細胞瘤H22的體內生長，也能顯著提高肝癌HepS細胞的凋亡率[28]。

4 抗其它消化系腫瘤作用

UA抑制人舌鱗癌TSCCa細胞漿中核因子-κB mRNA的表達，IC50為1.25 μM[29]。

UA（20～50 μM）顯著抑制人食管癌Eca-109細胞增殖，電鏡下可見典型的凋亡形態(tài)和壞死形態(tài)。機制研究發(fā)現(xiàn)，UA的抗Eca-109細胞作用與其提高Bax和p27 kip1蛋白表達、下調Bcl-2表達和將細胞滯留在G0/G1期有關[30]。UA、OA或含UA、OA等三萜化合物的日本杏提取物與氟尿嘧啶聯(lián)用對食管鱗狀癌YZS-2細胞的細胞毒作用有相加或協(xié)同作用，使細胞周期滯留在G2/M期和S期并誘導凋亡。在嚴重免疫缺陷小鼠腹腔注射YES-2細胞制造的腹腔血性腹水食管癌模型中，此種日本杏提取物可增強氟尿嘧啶的抗癌作用，使直徑大于2 mm的腹腔結節(jié)數(shù)少于單用氟尿嘧啶或日本杏提取物治療組[31]。

5 抗誘變和抗促癌作用

女貞子中的OA和UA濃度依賴性對抗苯并芘對鼠傷寒沙門菌的誘變活性，其中UA抗誘變作用強于OA[32]。UA在上述Ames試驗中也抑制黃曲霉毒素B1的誘變性[33]。小鼠外周血和骨髓微核試驗表明，灌服80 mg/kg的UA、OA或OA和UA混合物都能顯著降低阿霉素所致微核發(fā)生率[34]。皮下注射OA 50、75和100 mg/kg發(fā)現(xiàn)，OA劑量依賴性抑制烏拉坦或環(huán)磷酰胺所致微核率（染色體損傷）的明顯升高[35]。UA也明顯降低環(huán)磷酰胺所致微核發(fā)生率[36]。UA和OA本身無致突變作用。UA的抗基因毒作用需要預先通過細胞介導（預先與細胞一起培養(yǎng)），如與特丁基過氧化氫一起同時與細胞培養(yǎng)，則不能阻滯HepG2細胞中的DNA氧化損傷。此外，UA還有DNA修復功能[37]。最近研究發(fā)現(xiàn)，UA不僅對過氧化氫引起的人結腸腺癌Caco-2細胞中的DNA損傷有保護作用，也能提高過氧化氫性DNA損傷的修復率，提示UA有抗結腸癌發(fā)生的作用[38]。

給大鼠連續(xù)6周灌服20 mg/kg UA可對抗二乙基亞硝胺誘導、苯巴比妥促進的氧化應激性肝細胞癌形成，明顯降低肝組織過氧化脂質和蛋白碳酰水平，恢復組織和漿膜ATP酶活性以及糖蛋白水平，有效抑制氧化應激對大鼠肝臟的傷害[39]。

體內、外實驗表明，OA和UA能抑制佛波醇酯的促癌作用，對佛波醇酯誘導Raji細胞中EB病毒早期抗體活化具有幾乎與維甲酸相同的抑制作用，并使Raji細胞的存活率更高。二階段致癌實驗也發(fā)現(xiàn)，外涂OA或UA明顯抑制佛波醇酯對二甲基苯并蒽誘導的小鼠皮膚癌的促癌作用，其中UA的作用更強些。OA和UA并不影響佛波醇酯與受體結合，但明顯抑制促癌劑佛波醇酯提高小鼠皮膚鳥氨酸脫羧酶活性，引起多胺枯竭，導致生長抑制，使細胞周期滯留在G1期并出現(xiàn)細胞分化[33]。OA對抗佛波醇酯誘導皮膚金屬硫因基因表達和無機磷摻入人宮頸癌細胞磷脂[40，41]，產生抗促癌作用。

6 增強免疫作用

OA和UA都有保護和提高宿主防御功能、增強機體抗腫瘤的能力。OA和UA不僅促進小鼠放療后造血系統(tǒng)恢復，提高外周血白細胞數(shù)，刺激脾細胞增殖，增強放療后植物血凝素誘導脾淋巴細胞母細胞化反應[42]，還能提高吞噬細胞的防御功能。OA和UA在不影響人外周血單核細胞增殖的濃度（1.25～20 mg/L）下就能刺激γ-干擾素分泌[43]。OA還通過濃度依賴性轉活核因子-κB，上調小鼠巨噬細胞中的誘生型一氧化氮合成酶和腫瘤壞死因子基因表達，刺激一氧化氮和腫瘤壞死因子合成和釋放。OA的上述作用在50 μM時達到坪值，濃度大于200 μM后對巨噬細胞產生毒性[44]。用UA進行上述實驗也獲得了相似結果[45]。此后日本學者報道，給小鼠皮膚外涂UA顯著促進皮膚環(huán)氧化酶-1和環(huán)氧化酶-2以及腫瘤壞死因子-α mRNA表達。體外實驗發(fā)現(xiàn)，UA通過激活細胞外信號調節(jié)激酶-2，觸發(fā)休止的巨噬細胞釋放游走抑制因子，但不提高細胞內游走抑制因子mRNA表達。UA也濃度和時間依賴性促進小鼠腹腔巨噬細胞促進白介素-1β和白介素-6以及游走抑制因子釋放。給ICR品系小鼠腹腔注射UA也可提高結腸黏膜白介素-1β分泌水平和髓過氧化物酶活性。進一步研究證明，UA與巨噬細胞上的CD36結合，激活NADPH氧化酶，使活性氧生成而激活p38 MAPK（絲裂原激活的蛋白激酶）、ERK1/2（細胞外信號調節(jié)激酶1/2）和半胱天冬酶-1，誘導白介素-1β釋放，同時通過ATP結合盒轉運蛋白誘導白介素-1β釋放。UA誘導白介素-1β釋放可因不同品系小鼠巨噬細胞中CD36和NADPH氧化酶表達狀態(tài)的差異而有所不同[46～49]。因此，OA和UA能在不損傷吞噬細胞的濃度下促進吞噬細胞釋放白介素-1β、γ-干擾素、一氧化氮和腫瘤壞死因子等細胞因子，從而抑殺機體內的腫瘤細胞。

腹腔注射UA、OA或甘草酸都可提高小鼠白細胞數(shù)，UA和OA連續(xù)注射6 d使小鼠白細胞數(shù)達最多，增加百分率分別為91%±5%和136%±6%，而甘草酸需9 d達到最多，增加百分率為115%±18%，可見OA升高白細胞數(shù)作用最強，同時也增加骨髓細胞構成和α-酯酶陽性細胞數(shù)。將此三藥與抗原一起處理動物時都可提高脾臟空斑形成細胞數(shù)和特異抗體滴度[50]。UA能對抗環(huán)磷酰胺的免疫抑制作用，提高小鼠外周血白細胞數(shù)、巨噬細胞吞噬功能和脾臟指數(shù)，促進脾淋巴細胞增殖[28]，刺激脾細胞白介素-2和γ-干擾素生成[51]。

我國學者早在上世紀80年代就對OA的促進免疫作用進行了研究。體外實驗表明，OA本身無絲裂原樣作用，但能增強植物血凝素、美洲商陸絲裂原、刀豆蛋白A和白介素-2等多種絲裂原對正常人及腫瘤病人淋巴細胞的增殖作用，對抗腫瘤病人抑制性T細胞在混合淋巴細胞培養(yǎng)中對正常人淋巴細胞增殖的抑制作用，對抗刀豆蛋白A誘導的抑制性淋巴細胞抑制異體淋巴細胞對絲裂原的增殖反應，但不影響NK細胞的功能。皮下注射OA 50和100 mg/kg可升高正常小鼠血清抗體IgG含量，但不影響溶血素抗體含量；能對抗可的松所致小鼠胸腺和脾臟萎縮。灌服OA 100 mg/(kg·d)能增強正常小鼠巨噬細胞的吞噬功能，使荷瘤小鼠低下的細胞免疫功能（遲發(fā)超敏反應）回復到正常水平?？墒且灿袌蟮?，灌服OA或齊酞酸鈉（OA的一種前體藥物）25、50和100 mg/(kg·d)并不影響小鼠單核巨噬細胞的吞噬功能，但皮下注射和腹腔注射時可劑量依賴性明顯提高小鼠單核巨噬細胞的吞噬功能[52]。

15例經化、放療治療的恢復期惡性腫瘤病人口服OA膠囊40 mg、bid共1月，服藥前低下的淋巴細胞轉化率即刺激指數(shù)由37±24升至72±38，巨噬細胞吞噬率由原來的37%±19%升至53%±10%，但不影響惡性腫瘤病人的NK細胞功能。在一項包括152例中、晚期癌癥病人的多中心、前瞻性、雙盲臨床試驗中，103例服OA片40 mg、tid，共1～2月。結果與安慰劑對照組（49例）比較，OA組病人的免疫功能明顯改善，如巨噬細胞吞噬率由37.9%提高到49.0%，E-玫瑰花結形成率由42.8%提高到48.2%，遲發(fā)超敏反應（舊結核菌素試驗）也明顯提高。多數(shù)病人服OA后一般狀況好轉，食欲增進，血紅蛋白、白細胞和血小板數(shù)上升率分別為63%、75%和79%，且無明顯副作用和肝、腎功能異常[53]。

誘導樹突狀細胞成熟是引起抗原特異性T淋巴細胞反應的關鍵，為開發(fā)抗癌的樹突狀細胞疫苗所必需。韓國Jung等[54]最近報道，UA能誘導人單核細胞衍生的樹突狀細胞表型和功能成熟：UA輕度提高樹突狀細胞表達抗原提呈的關鍵分子CD1a、CD80、CD83、CD86、HLA-DR和CCR7能力，濃度依賴性提高T細胞在同種混合的淋巴細胞反應中的刺激能力和向癌細胞（CCL19和CCL21）的移行能力。進一步研究發(fā)現(xiàn)，UA是通過誘導樹突狀細胞表達編碼把關樣受體-2和把關樣受體-4的mRNA，誘生白介素-12 p70，促使輔助T細胞（Th1）極化，激活人樹突狀細胞功能并誘導γ-干擾素產生，從而提高機體抗癌免疫功能的。

7 結語

OA和UA抗消化系腫瘤的作用可歸納如下：1）OA主要是使癌細胞壞死，而UA使癌細胞凋亡和壞死，抑制細胞增殖；2）抑制細胞突變，對抗化學品的促癌作用，阻礙腫瘤形成；3）增強機體免疫功能是OA和UA的間接抗腫瘤作用機制，而OA的促進免疫作用似乎強于UA。OA和UA廣泛分布在各種蔬菜和水果之中，可見多食蔬菜和水果對防治腫瘤是十分有益的。

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（收稿日期：2010-12-27）