劉雨晴，薛 明，周方園，徐華強

(1.山東農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，山東泰安271018；2.河南省科學院天然產(chǎn)物重點實驗室，河南鄭州450002)

植物體內(nèi)的生物堿不僅可直接利用，還可作為仿生合成新型害蟲控制劑的先導化合物。以煙堿為先導化合物開發(fā)的氯化煙酰類殺蟲劑，因具有作用方式新穎、高效、低毒和殺蟲范圍廣譜等特點，倍受國內(nèi)外重視，現(xiàn)已成為應(yīng)用最廣泛的小型昆蟲防治劑［1］。

黃荊(Vitex negundo L.)為牡荊屬(Vitex L.)落葉灌木，在傳統(tǒng)醫(yī)藥中應(yīng)用廣泛，具有抗菌消炎、鎮(zhèn)痛和抗氧化等作用［2－4］。作者所在課題組的前期研究結(jié)果已經(jīng)明確黃荊提取物對一些儲糧害蟲和蚜蟲等農(nóng)業(yè)害蟲具有明顯的殺蟲活性［5－7］。生物堿是黃荊所含的次生代謝產(chǎn)物之一［8］，目前，有關(guān)黃荊的研究主要集中在黃荊提取物及其萜烯類成分對農(nóng)業(yè)害蟲的防治方面［9］，而黃荊種子中生物堿對農(nóng)業(yè)害蟲的作用尚未見報道。

為了明確黃荊種子總生物堿對農(nóng)業(yè)害蟲的生物活性及其毒力機制，作者以棉蚜(Aphis gossypii Glover)無翅成蚜為試蟲，系統(tǒng)研究了黃荊種子總生物堿對棉蚜無翅成蚜的殺蟲作用，并據(jù)此探討其作用機制，為黃荊的綜合開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試黃荊種子于2007年采自山東泰山的山坡，原植物由山東農(nóng)業(yè)大學林學院李建教授鑒定。種子于室內(nèi)陰干后，用WK－1600A型中藥粉碎機(山東省青州市精誠醫(yī)藥裝備制造有限公司)粉碎，過40目銅篩，備用。

供試棉蚜無翅成蚜采自山東泰安郊區(qū)的棉田，以傳統(tǒng)棉花營養(yǎng)液［10］培養(yǎng)的‘豐抗6號’棉苗進行飼養(yǎng)，置于溫度(25±1)℃、相對濕度60％～75％、光照時間14 h·d－1的LRH－250－G恒溫光照培養(yǎng)箱(廣東省醫(yī)療器械廠)內(nèi)連續(xù)飼養(yǎng)。

實驗中使用的碘化硫代乙酰膽堿(ATC)、谷胱甘肽、毒扁豆堿、固藍B鹽和牛血清蛋白等均為美國Sigma公司產(chǎn)品；溴甲酚藍、鄰苯二酚、α－乙酸萘酯、十二烷基硫酸鈉(SDS)、1－氯－2，4－二硝基苯(CDNB)、5，5－二硫代雙－(2－硝基苯甲酸)(DTNB)和考馬斯亮藍等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 總生物堿提取方法 參照文獻［11］的酸水溶液提取法提取總生物堿。按質(zhì)量體積比1∶3的比例將黃荊種子粉末和甲醇混勻，于25℃恒溫條件下冷浸72 h，期間振蕩多次，然后將混合物抽濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去多余溶劑，得到黃荊種子的甲醇提取物浸膏［12］。加入4倍體積的體積分數(shù)5％HCl溶液，攪拌后靜止，待明顯分層后收集酸水層；殘渣按上述方法再重復處理2次，合并3次萃取的酸水層，抽濾后按濾液體積加入1/3體積的三氯甲烷進行萃取，棄去三氯甲烷層，再重復萃取2次；在經(jīng)過萃取處理的濾液中加入3倍體積的三氯甲烷并充分振搖，迅速用氨水調(diào)節(jié)至pH 10～pH 11，振搖3 min，靜置，分層后取三氯甲烷層，如此反復處理5～6次，合并三氯甲烷層，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到總生物堿粗品。

1.2.2 生物活性測定方法 觸殺毒力測定：參照文獻［13］的毛細管點滴法進行觸殺毒力測定。以丙酮(含質(zhì)量體積分數(shù)0.2％蘇丹紅和體積分數(shù)1％蒸餾水)為溶劑，將總生物堿粗品分別稀釋成質(zhì)量濃度0.625、1.250、2.500、5.000和10.000 g·L－1的總生物堿溶液。選取大小一致的棉蚜無翅成蚜，用毛細管點滴器點滴總生物堿溶液，每頭成蚜0.033 8μL；對照(CK)組則點滴等體積丙酮；每處理15頭試蟲，重復5次。在塑料盒(直徑6 cm、高5 cm)內(nèi)裝入用濕棉球包住葉柄的棉花葉片，將處理后的試蟲用毛筆挑入盒內(nèi)，置于溫度(25±1)℃、相對濕度(75±5)％、光照時間14 h·d－1的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后檢查存活和死亡試蟲的數(shù)量。所得數(shù)據(jù)用Finney機率分析法［13］進行處理，求得毒力回歸方程和 LD50以及LD30(使棉蚜無翅成蚜死亡50％和30％的總生物堿質(zhì)量)。

忌避毒力測定：采用周瓊等［14］的方法并加以改進。用丙酮將總生物堿粗品配制成質(zhì)量濃度0.500、1.000、2.000、4.000和8.000 g·L－1的供試溶液；將10 mL質(zhì)量體積分數(shù)1％的瓊脂倒入培養(yǎng)皿(直徑12 cm)中央，冷卻后待用；棉花葉片剪成直徑4 cm的圓片，正面朝下緊貼于瓊脂上；以葉背主葉脈為分界線，一側(cè)用總生物堿溶液10μL均勻涂布，作為處理區(qū)；另一側(cè)用丙酮10μL涂布，作為對照(CK)區(qū)；待葉片晾干成膜后，將成蚜用毛筆輕輕挑到葉背中脈上，每一培養(yǎng)皿16頭試蟲，用保鮮膜封住皿口，用昆蟲針刺上多個通氣孔后，置于溫度(25±1)℃、相對濕度(75±5)％、光照時間14 h·d－1的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每一培養(yǎng)皿視為1次重復，每處理重復6次。分別于24、48和72 h后檢查葉背處理區(qū)和對照區(qū)試蟲的棲息數(shù)，計算忌避率及忌避中濃度(AFC50)。忌避率=〔(對照區(qū)試蟲數(shù)－處理區(qū)試蟲數(shù))/對照區(qū)試蟲數(shù)〕×100％。

對成蚜存活率和繁殖力影響的測定：采用改進的葉子圓片法［15］飼養(yǎng)。以上述實驗確定的總生物堿LD30劑量(每頭0.045μg)點滴成蚜，對照組則點滴0.045μg丙酮。在培養(yǎng)皿中加入10 mL質(zhì)量體積分數(shù)1％瓊脂，冷卻后將棉花葉片正面朝下緊貼在瓊脂上，將試蟲用毛筆輕輕挑到棉花葉片的背面，單頭飼養(yǎng)，用保鮮膜封住培養(yǎng)皿，刺上多個通氣孔，置于溫度(25±1)℃、相對濕度(75±5)％、光照時間14 h·d－1的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。處理和對照均重復20次。每天檢查死亡和存活的試蟲數(shù)和新產(chǎn)的若蚜數(shù)，并及時將新產(chǎn)的若蚜去除，直到成蚜全部死亡為止。

對成蚜蜜露分泌影響的測定：棉蚜無翅成蚜蜜露分泌包含排蜜量、蜜滴質(zhì)量和排蜜頻率3個指標。排蜜量測定參照楊益眾等［16］的方法并略加改進。以LD30劑量(每頭0.045μg)點滴成蚜，對照組則點滴0.045μg丙酮。在一次性塑料杯(直徑6 cm、體積100 mL)中加入質(zhì)量體積分數(shù)1％瓊脂15 mL，凝固后，將直徑4 cm的棉花葉圓片正面朝下貼于瓊脂上，將成蚜接在葉圓片上，每杯5頭。待試蟲固定后，檢查葉背面固定的試蟲數(shù)，處理和對照各重復20次。根據(jù)試蟲的排蜜行為，將塑料杯倒置在已知質(zhì)量的保鮮膜上，置于溫度(25±1)℃、相對濕度(75±5)％、光照時間14 h·d－1的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后用FA1004電子天平(上海邁哲電子科技有限公司)稱取保鮮膜質(zhì)量，計算排蜜量。

蜜滴質(zhì)量測定參照文獻［16］的方法并略加改進。在前述排蜜量測定的基礎(chǔ)上1 h旋轉(zhuǎn)1次杯子，旋轉(zhuǎn)角度每次不超過30°，以避免蜜滴重疊。12 h后統(tǒng)計保鮮膜上的蜜滴數(shù)并稱取質(zhì)量，計算每滴蜜露的質(zhì)量。

排蜜頻率的測定參照孟玲等［17］的方法并略加改進。試蟲前處理同排蜜量的測定，將直徑15 cm的濾紙沿半徑剪1條中縫，用質(zhì)量體積分數(shù)0.2％溴甲酚藍無水乙醇溶液處理并陰干后套在葉片背面接有成蚜的棉株莖基部，每處理5頭成蚜，各重復20次；置于溫度(25±1)℃、相對濕度(75±5)％、光照時間14 h·d－1的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。12 h更換1次濾紙，共觀察24 h，蜜滴落點處濾紙由黃變藍，記錄濾紙上的藍點數(shù)(即蜜滴數(shù))和棉花葉片背面的成蚜數(shù)，計算單頭成蚜每天的排蜜頻率。

1.2.3 對棉蚜無翅成蚜離體酶活力影響的測定 乙酰膽堿酯酶比活力的測定：將400頭棉蚜無翅成蚜置于2 mL磷酸緩沖液(0.1 mol·L－1，pH 7.5)中，于冰浴中用玻璃勻漿器勻漿，然后用CR22高速冷凍離心機(日本日立公司)于4℃、4 000 r·min－1離心15 min，上清液即為供試酶液。用丙酮將總生物堿粗品分別配制成質(zhì)量濃度0.312 5、0.625、1.250、2.500和5.000 g·L－1的溶液待用；參照Ellman等［18］的方法測定乙酰膽堿酯酶活性。反應(yīng)體系總體積為3.0 mL，包括酶液0.2 mL〔對照以0.2 mL磷酸緩沖液(0.1 mol·L－1，pH 7.5)代替酶液〕、ATC－DTNB混合溶液(體積比1∶2)0.1 mL、總生物堿溶液0.1 mL以及磷酸緩沖液(0.1 mol·L－1，pH 7.5)2.1 mL，于27℃水浴反應(yīng)15 min，加入1 mmol·L－1毒扁豆堿0.5 mL終止反應(yīng)，混勻后用UV－2450紫外－可見光分光光度計(日本島津公司)于波長412 nm處測OD值，重復3次。以1 min內(nèi)1 mg蛋白質(zhì)水解碘化硫代乙酰膽堿的量作為乙酰膽堿酯酶的比活力。

多酚氧化酶活力的測定：將400頭成蚜置于2 mL磷酸緩沖液(0.2 mol·L－1，pH 6.8)中，勻漿后于6 000 r·min－1離心30 min，上清液即為供試酶液。用丙酮將總生物堿粗品分別配制成質(zhì)量濃度0.500、1.000、2.000、4.000和8.000 g·L－1的溶液待用。以100 mmol·L－1鄰苯二酚1.5 mL為底物，加入磷酸緩沖液(0.2mol·L－1，pH 6.8)1.3 mL和總生物堿溶液0.1 mL，于30℃水浴處理30 min，加入酶液0.1 mL〔對照以0.1 mL磷酸緩沖液(0.2 mol·L－1，pH 6.8)代替酶液〕，混勻后立即于波長420 nm處測定2 min內(nèi)OD值的變化，重復3次。以1 min內(nèi)1 mg蛋白質(zhì)使OD值改變0.001所需的酶量為1個酶活力單位。

羧酸酯酶比活力和谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶活力的測定：將400頭成蚜置于2 mL磷酸緩沖液(0.04 mol·L－1，pH 7.0)中，勻漿后于4 000 r·min－1離心20 min。上清液為谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶供試酶液，將上清液稀釋500倍作為羧酸酯酶供試酶液。

參照文獻［19］的方法測定羧酸酯酶的比活力。用丙酮將總生物堿粗品分別配制成質(zhì)量濃度0.150、0.300、0.600、1.200和2.400 g·L－1的溶液。反應(yīng)體系包含0.3 mmol·L－1α－乙酸萘酯(含1μmol·L－1毒扁豆堿)5 mL，于25℃溫育5 min；加入總生物堿溶液0.1 mL和酶液0.1 mL〔對照以0.1 mL磷酸緩沖液(0.04 mol·L－1，pH 7.0)代替酶液〕，于30℃水浴中振蕩處理30 min，再加入顯色劑(1％固藍B鹽和5％SDS按體積比2∶5混合而成)1.0 mL，混勻后于室溫下放置30 min，待顏色穩(wěn)定后，于波長600 nm處測定OD值，重復3次。以1 min內(nèi)1 mg蛋白質(zhì)水解α－乙酸萘酯的量作為羧酸酯酶的比活力。

參照文獻［20］的方法測定谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶的活力。用丙酮將總生物堿粗品分別配制成質(zhì)量濃度1.000、2.000、4.000、8.000和16.000 g·L－1的溶液待用。反應(yīng)體系包含磷酸緩沖液(66 mmol·L－1，pH 7.0)2.4 mL、50 mmol·L－1谷胱甘肽0.3 mL、0.03 mol·L－1CDNB 0.1 mL、酶液0.2 mL〔對照以0.2 mL磷酸緩沖液(66 mmol·L－1，pH 7.0)代替酶液〕和總生物堿溶液0.1 mL，立即測定波長340 nm處3 min內(nèi)OD值的變化，重復3次。以1 min內(nèi)1 mg蛋白質(zhì)使OD值改變0.001所需的酶量為1個酶活力單位。

上述實驗中均采用考馬斯亮藍法［21］測定可溶性蛋白質(zhì)含量。

1.2.4 對棉蚜無翅成蚜體內(nèi)酶活力影響的測定 選擇成蚜200頭，以上述實驗確定的總生物堿觸殺LD50劑量(每頭0.073μg)點滴，分別在處理后3、6、12和24 h按照前述方法制備酶源，重復3次。按照上述方法測定成蚜體內(nèi)乙酰膽堿酯酶、多酚氧化酶、羧酸酯酶和谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶的活力。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

用Finney機率分析法和SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析；對實驗數(shù)據(jù)進行t檢驗；用LSD法分析差異顯著性。

2 結(jié)果和分析

2.1 黃荊種子總生物堿對棉蚜無翅成蚜的觸殺毒力

根據(jù)不同質(zhì)量濃度黃荊種子總生物堿溶液對棉蚜無翅成蚜的觸殺毒力，以總生物堿質(zhì)量的對數(shù)為橫坐標(x)、棉蚜無翅成蚜死亡率的機率值為縱坐標(y)，得到線性回歸方程y=2.80+(2.46±0.15)x，黃荊種子總生物堿對單頭棉蚜無翅成蚜的 LD50為0.073μg，95％置信區(qū)間為0.065～0.081μg。苦豆子(Sophora alopecuroides L.)總生物堿噴霧處理棉蚜無翅成蚜24 h的LC50為0.984 g·L－1［22］。相比較而言，黃荊種子總生物堿對棉蚜無翅成蚜的觸殺毒力較為顯著。

2.2 黃荊種子總生物堿對棉蚜無翅成蚜的忌避毒力

不同處理時間黃荊種子總生物堿對棉蚜無翅成蚜的忌避毒力見表1。由表1可見：用不同質(zhì)量濃度黃荊種子總生物堿溶液處理棉蚜無翅成蚜后24、48和72 h的忌避中濃度(AFC50)分別為1.256、1.720和3.923 g·L－1。顯示黃荊種子總生物堿對棉蚜無翅成蚜具有一定的忌避作用和持續(xù)控制作用。

2.3 黃荊種子總生物堿對棉蚜無翅成蚜存活率和繁殖力的影響

以黃荊種子總生物堿LD30劑量(每頭0.045μg)處理棉蚜無翅成蚜，對照組與處理組成蚜存活率的比較見圖1。由圖1可見：經(jīng)黃荊種子總生物堿LD30劑量處理的成蚜，存活時間較對照縮短7 d；而在相同的處理時間內(nèi)，處理組的存活率逐漸降低且明顯低于對照。

表1 黃荊種子總生物堿溶液對棉蚜無翅成蚜忌避毒力的分析Table 1 Analysis of deterrent toxicity of total alkaloids solution from Vitex negundo L.seeds against apterous adults of Aphis gossypii Glover

圖1 黃荊種子總生物堿LD30劑量(每頭0.045μg)對棉蚜無翅成蚜存活率的影響Fig.1 Effect of total alkaloids at the dose of LD30(0.045μg per apterous adult)from Vitex negundo L.seeds on survival rate of apterous adults of Aphis gossypii G lover

此外，黃荊種子總生物堿LD30劑量能顯著抑制雌成蚜的繁殖力。處理組單頭雌成蚜繁殖力為11.2頭，對照組則為16.1頭，處理組單頭雌成蚜的繁殖力較對照組減少了30.43％。

2.4 黃荊種子總生物堿對棉蚜無翅成蚜蜜露分泌的影響

以黃荊種子總生物堿LD30劑量(每頭0.045μg)處理棉蚜無翅成蚜，單頭成蚜每天的平均排蜜量和平均排蜜頻率分別為(113.14±6.93)μg和(12.18± 0.51)滴，而對照組單頭成蚜每天的平均排蜜量和平均排蜜頻率分別為(140.24±8.11)μg和(16.44± 0.56)滴；處理組單頭成蚜每天的平均排蜜量和平均排蜜頻率分別較對照組減少了27.10μg和4.26滴，差異達到顯著水平。處理組成蚜的每滴蜜滴平均質(zhì)量略低于對照組，其中處理組為(6.74±0.18)μg，對照組為(7.33±0.15)μg，二者差異不顯著。

2.5 黃荊種子總生物堿對棉蚜無翅成蚜離體酶活力的影響

黃荊種子總生物堿對棉蚜無翅成蚜離體羧酸酯酶、乙酰膽堿酯酶和谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶的活力都有不同程度的抑制作用(表2)，其中，對離體羧酸酯酶活力的抑制作用最強，抑制中濃度(IC50)僅為0.778 g·L－1；對乙酰膽堿酯酶和谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶活力抑制作用的IC50分別為1.901和4.216 g·L－1。

表2 黃荊種子總生物堿溶液對棉蚜無翅成蚜3種離體酶活力的抑制效應(yīng)Table2 Inhibition effect of total alkaloids solution from Vitex negundo L.seeds on activity of three enzymes in vitro from apterous adults of Aphis gossypii G lover

黃荊種子總生物堿對棉蚜無翅成蚜離體多酚氧化酶活力的效應(yīng)見表3。由表3可見：與對照相比較，0.500～8.000 g·L－1總生物堿溶液對成蚜離體多酚氧化酶活力有明顯的激活作用，激活程度有明顯的劑量效應(yīng)，即：隨著黃荊種子總生物堿溶液質(zhì)量濃度的提高，多酚氧化酶的活力逐漸增強。

2.6 黃荊種子總生物堿對棉蚜無翅成蚜體內(nèi)酶活力的影響

以黃荊種子總生物堿LD50劑量(每頭0.073μg)處理棉蚜無翅成蚜，體內(nèi)乙酰膽堿酯酶、多酚氧化酶、羧酸酯酶和谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶活力的變化見表4。

表3 黃荊種子總生物堿溶液對棉蚜無翅成蚜離體多酚氧化酶活力的影響(±SE)1)Table 3 Effect of total alkaloids solution from Vitex negundo L.seeds on polyphenol oxidase activity in vitro from apterous adults of Aphis gossypii Glover(±SE)1)

表3 黃荊種子總生物堿溶液對棉蚜無翅成蚜離體多酚氧化酶活力的影響(±SE)1)Table 3 Effect of total alkaloids solution from Vitex negundo L.seeds on polyphenol oxidase activity in vitro from apterous adults of Aphis gossypii Glover(±SE)1)

1)同列中不同的小寫字母表示經(jīng)Fisher’s LSD法檢驗差異顯著(P≤0.05)Different small letters in the same column indicate the significant difference tested by Fisher’s LSDmethod(P≤0.05).

總生物堿質(zhì)量濃度/g·L－1活力/U Concentration of total alkaloids Activity 0.000(CK)15.541±1.264f 0.500 19.864±0.864e 1.000 23.993±1.331d 2.000 32.012±1.820c 4.000 37.447±1.394b 8.000 46.352±1.121a

與對照組相比，經(jīng)黃荊種子總生物堿LD50劑量處理棉蚜無翅成蚜后3、6、12和24 h，成蚜體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的比活力顯著降低，分別為對照的74.58％、73.70％、69.09％和61.73％，表明黃荊種子總生物堿對成蚜體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的比活力有顯著的抑制作用。與對照相比，用黃荊種子總生物堿LD50劑量處理成蚜后3～24 h，成蚜體內(nèi)羧酸酯酶的比活力和谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶的活力均受到顯著抑制，且前者的比活力降低幅度更大；處理后3、6、12和24 h，羧酸酯酶比活力分別僅為對照的66.24％、62.59％、54.71％和54.31％，而谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶的活力分別為對照的83.76％、82.08％、81.76％和85.24％。

與對照組相比，黃荊種子總生物堿LD50劑量處理對成蚜體內(nèi)多酚氧化酶活力有顯著的激活作用，處理后3、6、12和24 h，多酚氧化酶活力分別為對照的1.15、1.22、1.19和1.32倍。其原因可能是由于黃荊種子總生物堿誘導了成蚜的防御反應(yīng)，導致多酚氧化酶活力增加。

表4 黃荊種子總生物堿LD50劑量(每頭0.073μg)對棉蚜無翅成蚜體內(nèi)酶活力的影響(±SE)1)Table 4 Effect of total alkaloids at the dose of LD50(0.073μg per apterous adult)from Vitex negundo L.seeds on enzyme activity in vivo from apterous adults of Aphis gossypii G lover(±SE)1)

表4 黃荊種子總生物堿LD50劑量(每頭0.073μg)對棉蚜無翅成蚜體內(nèi)酶活力的影響(±SE)1)Table 4 Effect of total alkaloids at the dose of LD50(0.073μg per apterous adult)from Vitex negundo L.seeds on enzyme activity in vivo from apterous adults of Aphis gossypii G lover(±SE)1)

1)*：P≤0.05.

處理組Treatment group取樣時間/h Sampling time比活力/nmol·min－1·mg－1 Specific activity乙酰膽堿酯酶Acetylcholinesterase 羧酸酯酶Carboxylesterase活力/U Activity多酚氧化酶Polyphenol oxidase 谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶Glutathione-S -transferase對照CK 3 20.354±1.382* 7.103±0.339* 18.122±0.665 120.363±4.451*總生物堿Total alkaloids 3 15.181±0.744 4.705±0.395 20.925±0.702* 100.822±5.012對照CK 6 22.245±0.943* 8.794±0.362* 18.444±0.735 122.502±4.493*總生物堿Total alkaloids 6 16.394±1.083 5.504±0.405 22.452±1.136* 100.555±4.437對照CK 12 23.507±0.990* 9.404±0.315* 21.424±1.025 129.513±5.119*總生物堿Total alkaloids 12 16.241±1.174 5.145±0.293 25.436±0.796* 105.895±4.345對照CK 24 24.207±0.776* 8.402±0.414* 20.977±1.338 129.983±5.676*總生物堿Total alkaloids 24 14.942±1.154 4.563±0.395 27.585±1.553*110.795±4.795

3 討論和結(jié)論

生物堿是植物有毒成分中分布范圍最廣、組成成分最多的一類天然含氮有機化合物，已發(fā)現(xiàn)含生物堿的殺蟲植物有508種，分屬于108科，較多分布于蝶形花科(Papilionaceae)(27屬)、菊科(Compositae)(23屬)、茄科 (Solanaceae)(14屬)和夾竹桃科(Apocynaceae)(11屬)的植物中［23］。許多植物生物堿對昆蟲具有毒殺、拒食、忌避、抑制生長發(fā)育、不育和引誘等多種作用方式，如百部堿、苦參堿和藜蘆堿等對害蟲兼具觸殺和胃毒作用；哌啶生物堿對毛蟲、桃蚜、斜紋夜蛾和小菜蛾等都有明顯的毒殺效果［24］。目前國內(nèi)外已開發(fā)的生物堿類殺蟲劑有硫酸煙堿、黑葉40、藜蘆堿和以里安那堿等［25］。另外，植物生物堿也是人工“仿生”合成新殺蟲劑的重要先導化合物的主要來源，其中，氯化煙酰類殺蟲劑就是以煙堿為先導化合物成功開發(fā)并商品化的農(nóng)藥［26］，也是繼除蟲菊酯類后的第2大類仿生農(nóng)藥［27］。

據(jù)文獻報道：煙堿對蘿卜蚜無翅成蚜的LC50為1 090.65 mg·L－1［28］；氧化苦參堿對蠶豆蚜2齡若蚜和桃蚜混合種群的LC50分別為3 811.95和7 633.12 mg·L－1，槐果堿對蠶豆蚜2齡若蚜和桃蚜混合種群的LC50分別為3 300.70和4 619.04 mg·L－1［29］。本研究采用點滴法用黃荊種子總生物堿處理棉蚜無翅成蚜，對單頭棉蚜無翅成蚜的LD50為0.073μg，推測黃荊種子總生物堿的毒力比上述文獻報道的幾種生物堿更高。黃荊種子總生物堿對棉蚜無翅成蚜還有一定的忌避作用和持續(xù)控制效應(yīng)；以黃荊種子總生物堿LD30劑量處理棉蚜無翅成蚜，成蚜存活時間比對照明顯縮短且繁殖力降低，且對單頭成蚜的排蜜頻率和排蜜量以及每滴蜜滴質(zhì)量均有影響。表明黃荊種子總生物堿LD30劑量不但可顯著抑制棉蚜無翅成蚜種群增長，且致毒方式多樣，對害蟲的可持續(xù)控制作用強，具有一定的開發(fā)和利用價值。

生物堿對昆蟲的影響是多方面的，不僅可以作用于昆蟲的神經(jīng)系統(tǒng)，還可刺激或抑制昆蟲取食、影響昆蟲產(chǎn)卵以及抑制微粒體氧化酶等［30］。羅萬春等［28］的研究結(jié)果表明：苦豆子總堿和野靛堿對昆蟲的乙酰膽堿酯酶活性有顯著的抑制作用。而黃荊種子總生物堿不僅對棉蚜無翅成蚜的靶標酶——乙酰膽堿酯酶活力的抑制作用顯著，還對羧酸酯酶和谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶的活力有較強的抑制作用。乙酰膽堿酯酶對于昆蟲神經(jīng)興奮傳導起關(guān)鍵作用，其活性被抑制勢必影響甚至阻斷昆蟲神經(jīng)沖動的傳導；羧酸酯酶和谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶是昆蟲體內(nèi)2種最重要的解毒酶系，對解毒酶系的抑制將影響昆蟲對有毒外源物質(zhì)的氧化、代謝和解毒，進而影響其解毒代謝并引起死亡［31］。由此表明：黃荊種子總生物堿對棉蚜無翅成蚜的毒殺作用機制較為復雜。

研究結(jié)果顯示：黃荊種子總生物堿對棉蚜無翅成蚜離體及體內(nèi)多酚氧化酶活性有顯著的激活作用。多酚氧化酶廣泛存在于各種生物體內(nèi)，該酶在昆蟲變態(tài)發(fā)育過程中表皮的硬化和黑化、卵殼的鞣化過程以及對外源物質(zhì)的免疫防御過程均有十分重要的作用［32］。據(jù)文獻報道：外源物質(zhì)芹菜素對試蟲的酚氧化酶產(chǎn)生抑制作用，可以導致試蟲不能正常生長發(fā)育［33－34］；馬志卿等［35］報道：松油烯－4－醇對粘蟲多酚氧化酶也有明顯的抑制作用；劉偉等［36］認為：單寧酸對甜菜夜蛾的作用靶標為酚氧化酶，對酚氧化酶活性的抑制作用可導致試蟲不能完成正常的蛻皮變態(tài)過程，使試蟲生長發(fā)育受限直至死亡。因而，許多化合物對害蟲的毒殺作用機制是通過抑制害蟲體內(nèi)酚氧化酶的活性影響其生長發(fā)育過程，而黃荊種子總生物堿對棉蚜無翅成蚜多酚氧化酶活性具有激活作用，這一作用是否也會影響棉蚜無翅成蚜的發(fā)育過程?尚需進一步的研究。

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