摘 要：建立反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定大籽獐牙菜中10種成分的含量。方法：采用反相高效液相色譜，色譜條件為：Agilent XDB C18柱（Φ4.6×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：甲醇，B：水；洗脫方法：0～20 min，A為10%～30%，20～45 min A為30%～80%梯度洗脫；體積流量1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，230 nm，柱溫28 ℃。結(jié)果：10種成分均達(dá)到基線分離，各化合物的線性關(guān)系良好，r>0.999 5；各待測(cè)物的精密度RSD值均小于1.1%；重復(fù)性良好（RSD<3.7%）；回收率范圍在97.8%～104.2%，RSD<4.2%。結(jié)論：該方法測(cè)定成分多，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。
　　關(guān)鍵詞：反相高效液相色譜；大籽獐牙菜；酮；環(huán)烯醚萜
　　中圖分類號(hào)：R286.0 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-2349（2011）04-0064-02
　　大籽獐牙菜（Swertia macrosperm a C. B.Clark）系龍膽科（Gentianaceae）獐牙菜屬（Swertia）植物，主要產(chǎn)于西藏、貴州、云南等省^［1］，獐牙菜屬植物多具有清肝利膽、清熱除濕等功效，在民間不少地方用該屬植物治療黃疸型肝炎。張媛媛等^［2］對(duì)大籽獐牙菜化學(xué)成分進(jìn)行了研究，該植物中酮類、環(huán)烯醚萜類成分具有廣泛的生理活性。酮類化合物具有很好的保肝、降血糖、抗氧化等作用^［3~6］，裂環(huán)烯醚萜苷中的龍膽苦苷可明顯降低血清轉(zhuǎn)氨酶、促進(jìn)肝臟的蛋白質(zhì)合成，還能促進(jìn)膽汁及胃液的分泌，興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)，獐芽菜苦苷具有解痙、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜的活性，能促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)。此外，龍膽苦苷和獐芽菜苦苷均可促進(jìn)細(xì)胞膠原質(zhì)的產(chǎn)生以及有絲分裂活動(dòng)，加快創(chuàng)口愈合速度^［7~9］。對(duì)獐牙菜屬植物中齊墩果酸、龍膽苦苷、獐芽菜苦苷及酮含量的HPLC測(cè)定報(bào)道較多，楊慧玲等^［10］對(duì)大籽獐牙菜中7種有效成分進(jìn)行了測(cè)定。本試驗(yàn)建立了對(duì)大籽獐牙菜中10種成分的高效液相色譜的含量測(cè)定方法，為評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量及合理用藥提供了可靠依據(jù)。
　　1 儀器與試藥
　　Agilent1200高效液相色譜儀，配置為自動(dòng)進(jìn)樣器、高壓四元梯度泵、DAD檢測(cè)器、Agilent1200色譜工作站；Agilent XDB-C18柱（Φ4.6×150 mm d，5 μm）色譜柱；AS20500A超聲波清洗器；超純水儀。流動(dòng)相用甲醇為色譜純（美國(guó)Tedia公司），其他試劑均為分析純，水為超純水。斷馬錢子苷半縮醛內(nèi)酯（S1）、表斷馬錢子苷半縮醛內(nèi)酯（S2）、獐芽菜苷（S3）、龍膽苦苷（S4）、芒果苷（S5）、1O葡萄糖基2，3二氫1，4，6，8四羥基酮（S6）、1，3，5，6四羥基酮（S7）、2'O（3羥基苯甲酰基）獐芽菜苦苷（S8）、3，3'雙（3，4二氫4甲氧基6羥基2H1苯并吡喃）（S9）、1甲氧基3，7二羥基酮（S10）10種標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品均由本課題組制備，純度均在98%以上。植物樣品于2009年11月采自云南省玉溪市新平縣，經(jīng)云南中醫(yī)學(xué)院楊禮攀博士鑒定為龍膽科獐牙菜屬植物大籽獐牙菜。樣品陰干后粉碎過80目篩，室溫下保存，植物標(biāo)本存于云南民族大學(xué)民族藥資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本館。
　　2 方法與結(jié)果
　　2.1 色譜條件 Agilent XDB-C18（Φ4.6 mm×150 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇和水在0～20 min內(nèi)由10∶90至30∶70、20～45 min內(nèi)由30∶70至80∶20梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，230 nm，柱溫28 ℃。在該色譜條件下10種成分均達(dá)到基線分離。
　　2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制 精確稱取對(duì)照品S1 2.1 mg、S2 2.6 mg、S3 1.5 mg、S4 7.1 mg、S5 9.4 mg、S6 1.1 mg、S7 6.5 mg、S8 5.9 mg、S9 4.3 mg、S10 5.3 mg分別置10 mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容，配制成相應(yīng)濃度的對(duì)照品儲(chǔ)備液。
　　2.3 樣品溶液的制備 精確稱取粉碎至80目的待測(cè)樣品3份，每份1.000 g，分別加入40.00 mL甲醇置80 ℃水浴中索式提取75 min，提取后采取體積補(bǔ)償，過0.45 μm濾膜，在“2.1”色譜條件下測(cè)定峰面積。
　　2.4 線性關(guān)系的考察 取S1～S10 10種標(biāo)樣進(jìn)樣體積分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2、4、6、8、10 μL，以峰面積的積分值定量。S1～S10的回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表1。
　　2.5 精密度試驗(yàn) 取含S1 0.36 mg/mL、S2 1.07 mg/mL、S3 1.14 mg/mL、S4 0.69 mg/mL、S5 0.53 mg/mL、S6 0.94 mg/mL、S7 0.05 mg/mL、S8 0.93 mg/mL、S9 0.16 mg/mL、S10 0.15 mg/mL混合對(duì)照品溶液，在“2.1”色譜條件下測(cè)定色譜峰的峰面積，計(jì)算得RSD分別為0.82%、0.90%、0.73%、0.79%、1.1%、0.39%、0.95%、0.66%、0.82%、0.96%（n=6），表明儀器精密度良好。
　　2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精確稱取大籽獐牙菜樣品1.000 g，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，分別在0、2、4、6、8、16、24 h時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定S1～S10的峰面積，計(jì)算它們的RSD分別為1.2%、1.5%、1.8%、1.4%、2.1%、1.2%、1.7%、2.8%、2.3%、1.7%（n=7）。表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。
　　2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精確稱取3份1.000 g大籽獐芽菜樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，在“2.1”色譜條件下測(cè)定S1～S10的含量，計(jì)算得RSD分別為1.8%、1.4%、2.2%、3.2%、2.2%、1.3%、2.1%、3.5%、2.6%、3.6%（n=3），表明方法重復(fù)性良好。
　　2.8 回收率試驗(yàn) 精確稱取3份大籽獐牙菜樣品各1.000 g，精確量取各對(duì)照品溶液2.00 mL，按“2.1”項(xiàng)下方法操作，測(cè)得S1～S10的平均回收率（n=3）分別為103.1%、100.8%、98.2%、101.5%、99.6%、103.1%、98.9%、104.2%、97.8%、99.3%；RSD分別為3.7%、2.4%、2.8%、1.3%、3.6%、1.8%、4.1%、2.2%、1.9%、2.0%。
　　2.9 樣品測(cè)定 取“2.3”項(xiàng)下制備的樣品溶液按“2.1”色譜條件進(jìn)行分析，樣品色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖比較指認(rèn)（圖1）后按外標(biāo)法以峰面積積分值計(jì)算，得10種成分的百分含量分別為0.10%、0.02%、0.19%、0.35%、1.36%、0.10%、3.42%、0.17%、2.53%、0.14%（n=3）。
　　3 討論
　　3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 對(duì)照品溶液進(jìn)樣后，利用DAD檢測(cè)器在200～400 nm掃描其吸收光譜，對(duì)照品在254 nm和230nm波長(zhǎng)處有較高的吸收峰，選擇該波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng)。
　　
　　3.2 提取方法確定 比較了超聲、熱回流和索式提取3種不同提取方法；提取時(shí)間（30、45、60、75、90 min）對(duì)提取率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，索式提取法略優(yōu)于熱回流提取法和超聲，且索式提取75 min即可將有效成分提取完全，故該試驗(yàn)采用索式提取法。
　　3.3 流動(dòng)相的選擇 實(shí)驗(yàn)按“2.1”色譜條件進(jìn)行時(shí)發(fā)現(xiàn)不加磷酸的情況下，10種化合物均達(dá)到較好的基線分離且不拖尾，故選擇甲醇和水作流動(dòng)相。
　　3.4 該試驗(yàn)建立的高效液相色譜法具有簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠等優(yōu)點(diǎn)，獐芽菜苦苷、芒果苷的含量較楊慧玲等^［10］測(cè)定的有差異，這說明不同地域的大籽獐牙菜在成分含量上是有差別的。這對(duì)評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量、充分利用藥物資源有一定的參考意義。
　　參考文獻(xiàn)：
　?。?］中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編委會(huì).中國(guó)植物志（第62卷）［M］.北京：科學(xué)出版社，1988：397~399.
　?。?］張媛媛，管棣，謝青蘭，等.大籽獐牙菜化學(xué)成分研究［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2007，42（9）：1299~1301.
　?。?］Hajimehdipoor H，Sadeghi Z，Elmi S，et al. Protective effects of Swertia longifolia Boiss. and its active compound，swerchirin，on paracetamolinduced hepatotoxicity in mice［J］. J Pharm pharmacol，2006，58（2）：277~280.
　　［4］Basnet P，Kadota S，Shimizu M，et al. Bellidifolin：a potent hypoglycemic agent in streptozotocin （STZ）induced diabetic rats from Swertia japonica［J］.Planta Med，1994，60（6）：507~511.
　?。?］Saxena AM，Bajpai MB，Murthy PS，et al. Mechanism of blood sugar lowering by a swerchirincontaining hexane fraction （SWI）of swertia chirayita［J］. Indian J Exp Biol，1993，31（2）：178~181.
　?。?］Patro BS，Chintalwar GJ，Chattopadhyay S. Antioxidant activities of Swertia decussata xanthones［J］. Nat Prod Res，2005，19（4）：347~354.
　　［7］曹斐，李沖.龍膽屬植物化學(xué)成分及藥理作用的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)新藥雜志，2008，17（1）：28~29.
　?。?］江蔚新，何文順，趙璽.龍膽多糖的降血脂作用的研究［J］.黑龍江醫(yī)藥，2008，21（4）：33.
　?。?］江蔚新，趙璽.龍膽多糖的抗凝血作用的研究［J］.黑龍江醫(yī)藥，2008，21（5）：32.
　?。?0］楊慧玲，劉建全.9種“藏茵陳”原植物中的7種有效化學(xué)成分研究［J］.中草藥，2005（8）：1233~1237.
　?。ㄊ崭迦掌冢?010-12-30）
　　注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請(qǐng)以PDF格式閱讀原文