王立暉袁永俊王 芃李培駿

（1.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學院，天津 300222；2.西華大學，四川 成都 610039；3.溫州質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測院，浙江 溫州 325000）

酪蛋白酶解液中β－酪啡肽－7的液相色譜檢測

王立暉1袁永俊2王 芃1李培駿3

（1.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學院，天津 300222；2.西華大學，四川 成都 610039；3.溫州質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測院，浙江 溫州 325000）

研究活性多肽β－酪啡肽－7的檢測。采用高效液相色譜法對胃蛋白酶解樣品中活性肽（β－酪啡肽－7）進行測定。結(jié)果表明，對比標準品的保留時間發(fā)現(xiàn)水解0.5，1.5，2.5h的1，3，5號樣品含有β－酪啡肽－7。經(jīng)過重復進樣，結(jié)果仍然一致。

液相色譜；β－酪啡肽－7；胃蛋白酶

酪蛋白來源于乳，含有人體必需的8種氨基酸及日常食物中的限制氨基酸賴氨酸、蛋氨酸等，是一種完全蛋白質(zhì)（PER值為2.5），能夠非常好的促進生物體生長發(fā)育［1］。牛乳中酪蛋白（casein），約占總蛋白的78.8%，根據(jù)氨基酸組成和電泳行為有所不同分為α、β、κ、γ4種結(jié)構(gòu)，其中β－酪蛋白占酪蛋白總量的28.2%。酪蛋白在動物消化道中經(jīng)蛋白酶分解產(chǎn)生的肽段除了營養(yǎng)功能外其特殊生物學活性已受到廣泛重視［2］。

具有特殊生物功能和生理作用的肽總稱為生物活性肽，是目前營養(yǎng)學研究的熱點，包括酪蛋白經(jīng)蛋白酶水解后分離得到許多生物活性肽類物質(zhì)［3］。酪啡肽是來源于β－酪蛋白所以也稱β－酪啡肽。試驗中胃蛋白酶的水解專一作用主要是針對苯丙氨酸、酪氨酸和亮氨酸組成的肽鍵，對酪蛋白具有較好的水解度［4］。酪蛋白的酶解液中成分復雜，能否簡便高效的檢測出目標多肽成為研究熱點。農(nóng)業(yè)部乳品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心趙建國等［5］建立了一種較為便捷的分析方法即高壓反相液相色譜來測定乳中的酪蛋白的水解產(chǎn)物C12，獲得了一定的效果。南京農(nóng)業(yè)大學張源淑［6］以雜交瘤細胞株法與酪蛋白及其胃蛋白酶酶解消化液共同孵育并利用細胞活性鑒定法證明了酪蛋白經(jīng)胃蛋白酶處理后有阿片樣活性物質(zhì)釋放。上述方法均能對酪蛋白酶解液中的多肽進行檢測但是檢測程序均比較復雜。本試驗參考文獻［7］的方法，對于酪蛋白經(jīng)胃蛋白酶水解的產(chǎn)物是否含有目標肽β－酪啡肽－7進行檢測，旨在驗證高效液相色譜法能夠有效的檢測出酪蛋白酶解液中的β－酪啡肽－7。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

干酪素：生化試劑，北京奧博生物技術(shù)責任有限公司；

胃蛋白酶（P－7000）：酶活性1∶10 000，美國Sigma公司；

甲醛：分析純，成都科龍化工試劑廠；

交聯(lián)葡聚糖Sephadex G－15：上海博耀生物科技有限公司；

甲醇：色譜純，天津市博迪化工有限公司；

乙腈：色譜純，美國Methanol Fisher公司；

β－酪啡肽－7標準品：美聯(lián)西安生物科技有限公司；

其他試劑：均為分析純。

1.2 試驗儀器

pH計：PHS－25型，上海雷磁儀器廠；

恒溫磁力攪拌器：78HW－1型，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；

水浴恒溫振蕩器：SHA－B型，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司

超聲波儀：AS5150A型，美國Ultrasonic公司；

高效液相色譜儀：SHIMADZU型，日本島津公司；

紫外－可見監(jiān)測器：SPD－10A型，日本島津公司；

紫外－可見分光光度計：TU－1800PC型，北京普析通用儀器有限公司；

微孔過濾膜：型號（0.45nmφ50），上海市新亞凈化器件廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備 在酪蛋白底物濃度為10mg/mL，胃蛋白酶添加量為溶液總量1%，體系pH值為1.6，酶解溫度為55℃ 的條件下，分別水解0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5h制備7個樣品，再于4℃以4 000r/min離心10min，取上清液過濾，濾液于4℃保存?zhèn)溆茫?］。將交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex G－15用水溶脹后裝入1.7cm×57.5cm的分離柱中，使用Tris－HCl緩沖液洗脫平衡，緩沖液用量一般為床體積量2～3倍。然后將制備的樣品分別進柱分離。按照優(yōu)化的層析條件進行分離，并參考分離標準曲線進行目標峰的收集［9］。

1.3.2 樣品預處理 收集交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex G－15柱分離的目標峰，放入－74℃冰箱冷凍8h，然后放入冷凍干燥機，先打開制冷裝置預冷到－54℃，然后把樣品依次快速放入干燥機，密封好，開啟真空泵，真空冷凍干燥48h，取出樣品，記錄干重，待色譜檢測。

1.3.3 樣品檢測 根據(jù)文獻［7］的方法進行檢測，對比β－酪啡肽－7標準品檢測結(jié)果（保留時間29.912s）。使用微孔濾膜過濾和超聲波儀對溶劑進行預處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪蛋白水解

由表1可知，隨酶解時間的越長，樣品水解度逐漸增大。

表1 樣品編號及水解度Table 1 Numbers and hydrolysis degree of Sample

2.2 樣品檢測結(jié)果

通過文獻［7］建立的高效液相色譜檢測方法對于水解樣品1～7號進行高效液相色譜檢測，結(jié)果顯示2，4，6，7號樣品無明顯出峰，而1，3，5號樣品有明顯出峰，見圖1～3和表2。

圖1 樣品1色譜分析圖Figure 1 Sample No.1

圖2 樣品3色譜分析圖Figure 2 Sample No.3

圖3 樣品5色譜分析圖Figure 3 Sample No.5

表2 樣品分析結(jié)果Table 2 Result of Sample

對比β－酪啡肽－7標準品檢測結(jié)果保留時間29.912s發(fā)現(xiàn)部分樣品中含有β－酪啡肽－7，即是水解0.5，1.5，2.5h的1號，3號，5號樣品，經(jīng)過重復進樣，結(jié)果仍然保持一致。水解1.0，2.0，3.0，3.5h的樣品均未檢測出β－酪啡肽－7，分析可能是樣品中β－酪啡肽－7濃度過低，未達到試驗限。β－酪啡肽－7的檢測結(jié)果，出現(xiàn)了斷點，未出現(xiàn)理想中的連續(xù)變化，可能有幾個原因：① 酶解試驗中使用的胃蛋白酶（P－7000）純度欠佳，可能含有雜質(zhì)或其他混合酶類，會對胃蛋白的精確切割位點產(chǎn)生影響。② 大量的非目標產(chǎn)物即在不同水解時間生成的不同雜質(zhì)和多肽，可能會影響到分離與檢測。③ 在試驗操作中可能有一些人為操作誤差或一些未知因素而造成比較大的誤差，可能影響了最后的結(jié)果。

3 結(jié)論

本試驗參考文獻［7］的高壓反相液相色譜分析方法來測定的酪蛋白的水解產(chǎn)物中的β－酪啡肽－7，但是檢測的準確度和可重復性還有待提高。使用RP－HPLC法鑒定水解液中多肽是目前國內(nèi)外最多用的方法，但是由于酶解液中蛋白質(zhì)片段的種類多且黏度大，很難用一種方法實現(xiàn)高效的分離。采用更有效預處理方法、采用合適的流動相調(diào)節(jié)劑、采用更高效的分離柱會有效的提高分離效率，有待于下一步研究。

1 張必武，樂國偉，施用暉，等.乳蛋白源阿片肽－β－酪啡肽［J］.飼料研究，2001（6）：13～14.

2 Yu VY.The role of dietary nuclcotides in neonatal and infant nutrition［J］.Singapore Med.J.，1998，39（4）：145～50.

3 張必武，樂國偉，施用暉，等.乳蛋白源阿片肽－β－酪啡肽［J］.飼料研究，2001（6）：13～14.

4 鄒思湘.酪蛋白源活性肽［J］.生命的科學，1993，13（1）：18～20.

5 張源淑，鄒思湘.乳源阿片肽活性物質(zhì)對動物消化、代謝的影響［J］.中國飼料，2001（13）：14～15.

6 張源淑，陳偉華，鄒思湘.用HPLC測定酪蛋白酶解產(chǎn)物中的β－Casomorphin－7［J］.中國乳品工業(yè)，1999，27（1）：37～38.

7 孫勇民.β－酪啡肽－7的高效液相色譜檢測［J］.食品工業(yè)，2008（3）：49～53.

8 王立暉.胃蛋白酶水解酪蛋白生成β－酪啡肽－7的研究［J］.中國釀造，2010（4）：64～67.

9 白泉，葛小娟，耿信篤，等.反相液相色譜對多肽的分離、純化與制備［J］.分析化學研究簡報，2002，30（9）：1 126～1 129.

Examination ofβ－Casomorphin－7from casein by pepsin

WANG Li－h(huán)ui1YUAN Yong－Jun2WANG Peng1LI Pei－Jun3

（1.Tianjin Modern Vocation Technology College，Tianjin300222，China；2.Xi Hua University，Chengdu，Sichuan610039，China；3.Wenzhou Instiute of Technology and Calibration，Wenzhou，Zhejiang325000，China）

This paper mainly research on the examination of active polypeptideβ－Casomorphin－7.Using HPLC chromatography on pepsin solution in a sample ofβ－Casomorphin－7detection.Compared with the results of standard retention time found the hydrolysis of 0.5h，1.5h，2.5h，No.1，No.3.No.5samples containing beta casomorphin 7，after repeated sampling，the results remained consistent.

HPLC；β－Casomorphin－7；pepsin

10.3969 /j.issn.1003－5788.2011.06.035

四川省科技廳應用基礎(chǔ)項目（編號：0325127）

王立暉（1981－），男，天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學院講師，碩士。E－mail：wanglihui2008＠126.com

2011－08－01