宋 慧 苗敬芝 唐仕榮

（徐州工程學院食品工程學院，江蘇 徐州 221111）

響應(yīng)曲面優(yōu)化超濾分離花生粕活性肽的工藝

宋 慧 苗敬芝 唐仕榮

（徐州工程學院食品工程學院，江蘇 徐州 221111）

以花生粕為原料，采用雙酶法酶解制備活性肽，應(yīng)用不同截留分子量的超濾膜對酶解液進行分離純化，通過單因素試驗探討原料液pH值、操作壓力和時間等因素對花生活性肽超濾分離膜通量的影響，利用響應(yīng)曲面法對超濾工藝條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳超濾工藝參數(shù)：選用截留分子量10kD的超濾膜，原料液pH 8.2，壓力0.25MPa下，超濾38.9min，膜通量可達到27.68L/（min·m2）。超濾濾出液中氨基氮含量提高到4.6倍，氨基氮總量回收率達到90%左右，實現(xiàn)了樣品的分離純化與初步濃縮。說明超濾分離花生粕活性肽具有快速、方便、條件溫和、操作簡單等優(yōu)點。

花生粕；超濾；活性肽；響應(yīng)曲面；工藝研究

花生是世界上主要的油料作物之一?；ㄉビ秃蟮幕ㄉ芍泻?0%以上的蛋白質(zhì)和人體必需的8種氨基酸，除蛋氨酸含量較低外，其它必需氨基酸含量均接近或超過聯(lián)合國糧農(nóng)組織所規(guī)定的標準，且賴氨酸含量比大米、玉米高3～8倍，其有效利用率達98.94%［1，2］。但是這一寶貴的蛋白資源絕大部分被用作動物飼料［3］，造成了資源的極大浪費。近年來研究［4，5］發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)經(jīng)水解得到的肽類具有降血脂、降血壓、抗氧化、防衰老等生理功能，在生命活動中有著非常重要的作用，可廣泛用作藥物、疫苗和食品營養(yǎng)制劑等。而酶解法因其條件溫和、生產(chǎn)的肽安全性高已成為肽的主要生產(chǎn)方法［6］。

目前，從酶解液中分離肽類一般采用超濾法［7］，蛋白酶解物經(jīng)超濾膜過濾，按照分子量截留原理，將水解物分離成不同分子量范圍的肽段。超濾具有操作簡便、成本低廉、試驗條件溫和可有效防止肽變性失活等優(yōu)點，從而提高活性肽的產(chǎn)量和質(zhì)量。本試驗采用超濾技術(shù)分離花生粕蛋白酶解液中的活性肽，以膜通量為指標，探討超濾膜分子量大小、超濾壓力、時間以及酶解液pH值等因素對超濾的影響，通過響應(yīng)曲面法優(yōu)化超濾操作條件，提高膜通量的分離效果，為花生粕酶解液中多肽的超濾分離提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

花生粕：總蛋白質(zhì)平均含量為44.75%，徐州新沂崇本堂農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)有限公司；

鹽酸、氫氧化鈉：均為國產(chǎn)分析純試劑；

小試平板超濾膜設(shè)備及濾膜：FLOWMEM0250，廈門世達膜科技公司；

電子天平：FA2004B型，上海越平科學儀器有限公司；

低速大容量離心機：DL－5，上海安亭科學儀器廠；

精密pH計：PHS－3C，上海精密科學儀器有限公司；

恒溫干燥箱：GZY－DH.600－Ⅱ，上海躍進醫(yī)療器械廠。

1.2 方法

1.2.1 花生多肽的酶解制備 稱取粉碎花生粕1kg加入20L蒸餾水中，50℃攪拌保溫1h，調(diào)pH 8.5，加胰蛋白酶0.1kg，50℃酶解4h，再加入風味酶0.08kg。繼續(xù)酶解2h，90℃滅酶10min，冷卻后抽濾分離殘渣，4 800r/min離心10min，測定上清液pH值及氨基氮含量。酶解上清液中氨基氮的含量為1.61mg/mL。

1.2.2 花生多肽的超濾分離 采用小試平板超濾膜設(shè)備，板式膜組件，膜材料為親水性聚醚砜超濾膜，分子截留量分別選用5，10，30，50kD，將濾液加入超濾裝置，控制操作參數(shù)，記錄一定時間內(nèi)透過液的體積，計算膜通量［8］。

1.2.3 單因素試驗 在優(yōu)選超濾膜的基礎(chǔ)上考察超濾分離壓力、時間、料液pH值等因素對膜通量的影響。

1.2.4 響應(yīng)曲面法試驗設(shè)計 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇對膜通量影響最大的3個因素為自變量，膜通量為指標，利用Design－Expert的Box－Behnken設(shè)計響應(yīng)曲面試驗。

1.2.5 測定項目及方法

（1）蛋白質(zhì)含量：凱氏定氮法。

（2）氨基氮含量：甲醛法。

（3）膜通量：按式（1）計算。

式中：

J——膜通量，L/（min·m2）；

V——超濾液體積，L；

A——膜有效面積，m2；

T——超濾時間，min。

2 結(jié)果與分析

2.1 超濾分離花生多肽的單因素試驗

2.1.1 超濾膜的選擇 以酶解上清液為原料，不調(diào)節(jié)料液pH值（初始pH值為8左右），在壓力0.2MPa條件下，分別用分子量為5，10，30，50kD的超濾膜，每隔10min測量截留液體積，計算膜通量，結(jié)果見圖1。

由圖1可見，超濾通量隨截留分子質(zhì)量的增大而增加。對50kD的超濾膜，在超濾進行的前40min內(nèi)膜通量隨時間的延長呈快速下降趨勢，之后膜通量開始趨于穩(wěn)定，曲線變化平緩；對30kD的超濾膜，前20min內(nèi)膜通量隨時間呈快速下降趨勢，之后膜通量趨于穩(wěn)定。這可能是由于原料液中含有較多的大分子物質(zhì)，隨超濾的進行，膜面凝膠層增厚以及原料液中大分子組分的沉積，導致膜通量下降。而10kD和5kD的超濾膜的膜通量隨時間變化較小，能在較長時間保持穩(wěn)定過濾，且10kD的膜通量遠大于5kD的超濾膜，因此選用10kD的膜作進一步研究。

圖1 不同分子量膜對膜通量的影響Figure 1 Effect of different membrane on membrane flux

2.1.2 pH值對膜通量的影響 以10kD的膜為超濾膜，調(diào)節(jié)料液pH值，在壓力0.2MPa條件下，超濾30min，考察原料液pH值對超濾膜通量的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 pH值對膜通量的影響Figure 2 Effect of pH on membrane flux

由圖2可知，隨著pH值的升高，膜通量逐漸增大，當pH值為8時，膜通量達到最大，之后膜通量隨pH值增大開始下降。這可能是由于原料液中含有較多的蛋白質(zhì)，在等電點附近時，蛋白質(zhì)分子很容易被沉積在膜表面，使透過阻力增加，膜通量顯著下降；當pH值增大到偏離等電點時，膜通量升高；當pH值過高時，在較強的堿性介質(zhì)中蛋白質(zhì)容易發(fā)生變性，從而沉積在膜表面，降低膜通量。因此超濾料液的pH值控制在8左右較適宜。

2.1.3 壓力對膜通量的影響 以10kD的膜為超濾膜，料液pH值8，改變超濾壓力考察壓力對超濾膜通量的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 壓力對膜通量的影響Figure 3 Effect of pressure on membrane flux

由圖3可知，當壓力為0.05～0.2MPa時，隨壓力的增大膜通量近似直線上升；0.20～0.25MPa時膜通量變化不大，趨于穩(wěn)定；0.25MPa以后反而呈下降趨勢。這可能是由于壓力較低時，超濾處于壓力控制區(qū)，膜通量與膜兩側(cè)壓力差近似成正比；隨著壓力的繼續(xù)增大，由于界面濃差極化現(xiàn)象的產(chǎn)生，膜通量受壓差影響變?。粔毫^續(xù)增加時，膜表面開始形成凝膠層，隨著大分子物質(zhì)的沉積，凝膠層厚度增大，阻力增加，可能造成膜通量下降。因此操作壓力控制在0.25MPa左右為宜。

2.1.4 時間對膜通量的影響 以10kD的膜為超濾膜，料液pH值8，0.25MPa條件下超濾，每10min測量截留液體積，計算膜通量。時間對膜通量的影響見圖4。

圖4 時間對膜通量的影響Figure 4 Effect of time on membrane flux

由圖4可知，30min內(nèi)膜通量迅速下降，因為超濾運行初期膜表面沒有沉積物，阻力較小，膜通量較大，隨著超濾的進行，膜表面逐漸沉積原料液中的大分子物質(zhì)，形成凝膠層和產(chǎn)生濃差極化，膜通量迅速下降［7］；30～50min內(nèi)膜通量緩慢降低趨于平緩，說明此時膜通量處于較平穩(wěn)狀態(tài)；50min后膜通量繼續(xù)下降，可能是由于此時濾膜表面沉積了較多的大分子物質(zhì)，阻力顯著增大。為防止低效率運行及減少后續(xù)清洗工作的麻煩，30～50min內(nèi)運行較為適宜。

2.2 響應(yīng)曲面法試驗分析

2.2.1 模型的建立及其顯著性檢驗 在單因素的基礎(chǔ)上，選取超濾壓力、時間、料液pH值三因素，按照Box－Behnken試驗設(shè)計方案進行試驗，試驗因素水平編碼見表1，響應(yīng)曲面試驗結(jié)果見表2。

利用 Design－Expert V7.0.0通過逐步回歸對試驗數(shù)據(jù)（表2）進行回歸擬合，得到膜通量關(guān)于超濾分離的壓力、時間、料液pH值3個因素的二次多項回歸方程（式（2））：

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of RSM

表2 響應(yīng)面設(shè)計與試驗結(jié)果Table 2 Test design and results of RSM

由表3可知，模型具有高度的顯著性（P＝0.000 3），失擬項不顯著（P＝0.196 3），R2Adj＝0.919 9，信燥比13.004，遠大于4，說明回歸方程擬合度和可信度均較高，能夠用此模型對超濾過程進行分析和預測。

表3 響應(yīng)曲面二次回歸方程模型方差分析結(jié)果?Table 3 ANOVA results of quadratic regression model for response surface

2.2.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化 根據(jù)回歸分析結(jié)果作響應(yīng)曲面圖，結(jié)果見圖5～7。

由圖5～7并結(jié)合表3可知，模型中的一次項壓力和時間差異顯著，壓力、時間和pH的二次項對膜通量有極顯著影響，而各因素之間的交互作用較小。表明各因素對膜通量的影響不是簡單的線性關(guān)系。

圖5 壓力、時間及其相互作用的響應(yīng)曲面圖Figure 5 Response surface plot of pressure and time

圖6 壓力、pH及其相互作用的響應(yīng)曲面圖Figure 6 Response surface plot of pressure and pH

圖7 時間、pH及其相互作用的響應(yīng)曲面圖Figure 7 Response surface plot of time and pH

為進一步確定最佳超濾工藝參數(shù)，對所得方程進行逐步回歸，刪除不顯著項，然后求一階偏導，并令其為0，可得最優(yōu)工藝參數(shù)：原料液 pH 8.2，壓力 0.25MPa，超 濾時間38.9min，膜通量可達到27.31L/（min·m2）。為檢驗Box－Behnken試驗設(shè)計所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化出的工藝參數(shù)重復實驗3次，其平均膜通量為27.68L/（min·m2），與理論預測值相比，相對誤差約為1.35%，說明此最佳模型是可靠的，具有一定的實用價值。

對超濾濾出液和截留液作氨基氮含量分析，發(fā)現(xiàn)濾出液中氨基氮含量達到7.37mg/mL，比初始料液氨基氮含量提高了3.6倍；濾出液中氨基氮總量回收率達到90%左右，截留液中氨基氮總量不到10%，表明花生粕酶解液中多肽分子以小分子為主，絕大多數(shù)分子量小于10kD，經(jīng)過10kD濾膜超濾以后，絕大多數(shù)肽保留在濾出液中，與大分子蛋白質(zhì)等實現(xiàn)了良好的分離，同時實現(xiàn)了樣品的初步濃縮，達到了分離純化的目的，有利于花生粕多肽的進一步應(yīng)用。

3 結(jié)論

試驗結(jié)果表明，選用截留分子量10kD的超濾膜，具有較高的膜通量，能在較長時間保持穩(wěn)定過濾。調(diào)節(jié)原料液pH 8.2，在壓力0.25MPa條件下，超濾38.9min，膜通量可達到27.68L/（min·m2）。超濾濾出液中氨基氮總量回收率達到90%左右，氨基氮含量提高到7.37mg/mL，比初始料液中氨基氮含量提高了3.6倍，可同步實現(xiàn)花生活性肽的分離純化與初步濃縮。

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Study on optimization of ultrafiltration separation of peanut peptides by response surface methodology

SONG Hui MIAO Jing－zhiTANG Shi－rong

（School of Food Engineering，Xuzhou Institute of Technology，Xuzhou，Jiangsu221111，China）

Ultrafiltration separation technology of bioactive peptides from peanut meals enzymatic hydrolytic liquid was carried out with the membranes of different cut－off molecular masses by response surface methodology test.Effects of different membrane，pH of materiel liquid，operating pressure and time on membrane flux were investigated through single factor test，then three key factors affecting the membrane flux such as pH of materiel liquid，pressure and time were optimized by response surface methodology.The optimum conditions on membrane flux with ultrafiltration separation of peanut peptides were identified as the follows：the membrane with a cut－off molecular mass of 10kD，pH of materiel liquid as 8.2，operating pressure as 0.25MPa，and ultrafiltration time as 38.9min，membrane flux was up to 27.68L/（min·m2）.The content of amino nitrogen in the filtrate was up to 4.6times as it in initial raw material liquid，and the coefficient of recovery of amino nitrogen was up to about 90%.All the results showed that ultrafiltration separation method has good prospect in separation and concentration of peanut peptides because of its quick speed，convenience and mild conditions with a good selectivity and handle expediently.

peanut meal；ultrafiltration；bioactive peptides；response surface methodology；technological study

10.3969 /j.issn.1003－5788.2011.06.020

江蘇省科技攻關(guān)項目（編號：BE2006308）

宋慧（1960－），女，徐州工程學院副教授。E－mail：4506402＠qq.com

2011－06－20