張安民，張瑞萍，賈慧娟，王鵬程

（1.煙臺大學 體育學院，山東 煙臺 264005；2.山西大學 體育學院，太原 030006）

不同游泳運動方式對大鼠海馬cAMP影響的實驗研究

張安民1，張瑞萍1，賈慧娟2，王鵬程1

（1.煙臺大學 體育學院，山東 煙臺 264005；2.山西大學 體育學院，太原 030006）

目的：觀察游泳運動后大鼠海馬cAMP濃度變化，探討不同游泳運動方式對海馬cAMP的影響機制。方法：建立大鼠游泳運動模型 （持續(xù)運動、間歇運動），采用酶聯(lián)接免疫吸附劑法，觀察大鼠海馬cAMP濃度變化，并用統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。結果：運動后持續(xù)組和間歇組cAMP濃度均呈鋸齒形特征，但變化規(guī)律有明顯差異。持續(xù)組先降后升，與對照組相比在即刻、60min、120min、240min有所下降，有顯著差異 （p＜0.05）；在60min達到最低值 （p＜0.01）；運動后30min略高于對照組，無顯著差異性 （p＞0.05）。間歇組先升后降且變化幅度逐漸增大，與對照組相比運動后240min cAMP濃度達到峰值，有顯著性差異 （p＜0.01）；而運動后30min、120min cAMP濃度呈下降趨勢，有顯著性差異 （p＜0.01）；運動后即刻、60min cAMP濃度略有上升，無顯著差異 （p＞0.05）。結論：不同游泳運動方式對海馬cAMP的影響不同，具有一定的時效性。

海馬；第二信使cAMP；持續(xù)游泳運動；間歇游泳運動

運動能促進人的認知功能和個性發(fā)展，特別是學習記憶這種腦功能的高級形式［1］。大量動物實驗也表明，運動有助于動物海馬等與學習記憶密切相關腦區(qū)神經元的增殖、存活和分化，促進長時程增強的誘導，提高實驗動物的空間記憶和被動逃避記憶能力［2－3］。cAMP是最早確定的細胞內的第二信使，作為細胞功能的信號傳導物質參與學習記憶過程［4－5］。因此，研究海馬與cAMP的表達變化將會對海馬的學習記憶過程有重要意義。本實驗旨在探討不同游泳運動方式對大鼠海馬cAMP表達的時間變化規(guī)律及其可能的影響機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和分組

實驗動物：SD成年雄性大鼠55只，鼠齡3個月，體重250－300g，由山西醫(yī)科大學動物實驗中心提供。飼養(yǎng)條件：分籠飼養(yǎng)，每籠4只，自由飲食，自然晝夜節(jié)律光照，室溫20±5℃。相對濕度在40%至60%。將大鼠隨機分為對照組 （n＝5只）、持續(xù)運動組 （n＝25只）、間歇運動組（n＝25只）。

1.2 運動模型建立

采用游泳運動方式建立運動動物模型。游泳條件：塑鋼玻璃游泳池，150cm×60cm×70cm，水深為大鼠身體長度的2倍，約60cm，水溫保持在33℃ 至36℃ 之間，每個游泳池隨機分配5只大鼠。正式訓練前運動組大鼠進行3天適應性游泳訓練，三天的運動時間每天分別為15min、20 min、30min。隨后開始正式的游泳運動訓練，每周訓練6次，共訓練6周。負重為體重5%，游泳6min，休息4 min，每天連續(xù)進行10組。對照組不做任何運動，常規(guī)飼養(yǎng)，自由活動。訓練結束后吹干毛發(fā)，返回鼠籠。

1.3 體重測量

采用HD-2006B天平，對大鼠的體重進行全程測量。開始運動前測量一次，然后每周一運動前對所有大鼠進行體重測量、記錄，便于統(tǒng)計分析。

1.4 取材

最后一次游泳后，持續(xù)組和間歇組大鼠按運動后即刻、30min、60min、120min、240min五個時刻分別依次取材，操作如下：大鼠腹腔2%戊巴比妥鈉麻醉 （40mg／kg），斷頭，冰上取腦，置于－80℃液氮冷藏。對照組操作同上。

從液氮取出大鼠腦組織，復溫至常溫。根據(jù)大鼠立體定向圖譜，分離腦組織切取大鼠海馬組織約50mg—100mg，置于離心管，按10mg∶200ul比例加入0.01MPBS液，用超聲波細胞粉碎機將其制成乳白色懸液，12000r／min離心10分鐘，取上清液放入－4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 cAMP含量的測定

cAMP濃度的測定均采用雙抗體酶聯(lián)免疫吸附法 （Enzymes linked immunosorbant assays，ELISA法），大鼠環(huán)磷腺苷cAMP ELISA試劑盒購自美國R·B公司，均嚴格按說明書進行操作。檢測儀器采用Benchmark酶標儀 （BIORAD公司）。

具體操作步驟：①加樣：將100ul標準品、100ul標本加入相應反應板孔中；②輕輕混勻30s，封住板孔，37℃溫育90min；③洗板：甩盡板內液體，用洗滌液洗滌反應板 （每孔內加入350ul洗滌液），并去除水滴 （在厚疊吸水紙上拍干）；反復洗滌5次；④每孔加入100ul 1×Biotin。輕輕混勻30s，封住板孔，37℃溫育60min；⑤洗板：甩盡板內液體，用洗滌液洗滌反應板 （每孔內加入350ul洗滌液），并去除水滴 （在厚疊吸水紙上拍干）；反復洗滌5次；⑥每孔加入100ul 1×HRP。輕輕混勻30s，封住板孔，37℃溫育30min；⑦洗板：甩盡板內液體，用洗滌液洗滌反應板 （每孔內加入350ul洗滌液），并去除水滴 （在厚疊吸水紙上拍干）；反復洗滌5次；⑧每孔加入50ul顯色劑A和50ul顯色液B，輕輕混勻10s，37℃暗處溫育15±10min；⑨每孔加入100ul終止液 （Stop Solu-tion）。輕輕混勻30s；30min內在450nm處讀OD值；⑩以OD值為縱坐標，以標準品濃度為橫坐標，繪制標準曲線。并根據(jù)樣本的OD值查出其濃度，或用回歸方程計算其濃度。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS12.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。所有數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±s標準差表示，組間比較采用t檢驗，p＜0.05有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結果

2.1 不同游泳運動方式對大鼠體重的影響

從表1可以看出，不同游泳運動方式對大鼠體重影響非常明顯。訓練前三組大鼠 （對照組、持續(xù)組、間歇組）體重相比無顯著差異 （P＞0.05）；訓練后對照組大鼠體重增加較快；持續(xù)組大鼠體重在第2周明顯下降，隨后保持穩(wěn)定；間歇組大鼠體重略有增長，但組間無顯著性差異。間歇組、持續(xù)組大鼠體重均低于對照組，且具有非常顯著性差異 （P＜0.01）。說明兩種游泳訓練都有一定的運動強度，對大鼠的控體重有一定的影響。

表1 游泳訓練后大鼠體重影響結果

2.2 不同游泳運動方式對大鼠海馬cAMP濃度的影響

2.2.1 持續(xù)游泳運動對大鼠海馬cAMP濃度的影響

統(tǒng)計學處理結果顯示 （表2）：持續(xù)游泳運動后cAMP濃度先降后升，與對照組相比在即刻、60min、120min、240min有所下降，有顯著差異 （p＜0.05）；在60min達到最低值，有非常顯著性差異 （p＜0.01）；運動后30min略高于對照組，無顯著差異性 （p＞0.05）。

表2 大鼠海馬在五個不同時刻cAMP濃度變化 （持續(xù)游泳）

從圖1來看，運動后海馬cAMP濃度隨時間呈鋸齒形的變化，30min組上升幅度較大，隨后快速下降，120min、240min變化幅度逐漸趨于平緩。

2.2.2 間歇游泳運動對大鼠海馬cAMP濃度的影響

統(tǒng)計學處理結果顯示 （表3）：間歇游泳運動后cAMP濃度先升后降且變化幅度逐漸增大，與對照組相比運動后240min cAMP濃度達到峰值，有顯著性差異 （p＜0.01）；而運動后30min、120min cAMP濃度呈下降趨勢，有顯著性差異 （p＜0.01）；運動后即刻、60min cAMP濃度略有上升，無顯著差異 （p＞0.05）。

表3 大鼠海馬在五個不同時刻cAMP濃度變化 （間歇游泳）

從圖2來看，運動后，海馬cAMP濃度隨時間呈鋸齒形的變化，即刻、60min組變化幅度較小，隨后變化幅度逐漸增大，240min cAMP濃度突然升高，達到峰值。

圖1 持續(xù)游泳運動對大鼠海馬cAMP在不同時刻表達的時效性

圖2 間歇游泳運動對大鼠海馬cAMP在不同時刻表達的時效性

3 討論與分析

經過6周的游泳運動訓練：持續(xù)運動組大鼠體重略有下降但基本保持穩(wěn)定；間歇運動組大鼠體重增加相對緩慢，皮毛光亮，體形勻稱。對照組大鼠體重增加較快，顯得臃腫。說明兩種游泳訓練都有一定的運動強度，對大鼠的控體重可能有一定的影響，證明游泳運動模型的建立較成功。

cAMP是細胞內第二信使，參與學習和記憶過程［4－5］。在生理狀態(tài)下，神經細胞中cAMP由三磷酸腺苷 （ATP）經腺苷環(huán)化酶 （AC）催化生成，由磷酸二酯酶 （PDE）降解，二者的功能狀態(tài)維持神經細胞cAMP水平穩(wěn)定。第二信使的特點是在短時間內即可迅速產生，短時間內又可迅速滅活，從而具有信號傳遞的功能。也就是說，在外來信號的作用下，第二信使上游的信號傳導蛋白被激活后，利用特殊的原料，在短時間內催化生成大量的第二信使，實現(xiàn)從胞外信號到胞內的轉換和放大，同時在特定機制作用下，生成的大量第二信使被迅速降解或轉移，使細胞內第二信使的濃度迅速降低，以保證信號轉導的一過性。

運動作為典型的應激源，對cAMP濃度具有顯著性影響。羅艷蕊等［6］研究表明8周游泳訓練導致心臟代償性肥大，cAMP／cGMP比值減小。黃元汛、張鈞［7］研究發(fā)現(xiàn)，力竭運動使大鼠心肌中cAMP和cGMP均明顯高于對照組，說明力竭運動可造成心肌中cAMP和cGMP含量明顯升高。張安民［8－10］等研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)游泳訓練和間歇性負重游泳訓練能夠引起紋狀體cAMP濃度升高并產生后續(xù)時程變化，并且認為這種變化可能與c-fos原癌基因、神經細胞內鈣離子等有關。Zimmer［11］對實驗性壓力超負荷動物模型的研究發(fā)現(xiàn)，壓力超負荷與心肌cAMP和心肌肥厚顯著正相關；壓力超負荷誘導了心肌cAMP濃度上升，同時cGMP濃度下降，cAMP／cGMP比值增大，推測環(huán)核苷酸系統(tǒng) （cAMP／cGMP）可能介導了壓力超負荷導致心肌肥大的反應。同時心肌組織cAMP含量于術后0.5h明顯增加，術后5d時達峰值，術后30d降至正常。李衛(wèi)平等［12］實驗表明：服用抗氧化劑對耐力運動組和間歇運動組恢復期的心肌cAMP濃度具有一定的影響，而對這兩組恢復期的心肌cGMP濃度則并無顯著性作用；運動方式和抗氧化劑是影響心肌cAMP、cGMP濃度變化的主要因素。徐松德等［13］將34只家兔隨機分為對照、運動和不運動三組，后兩組每只家兔喂膽固醇200mg／d，試驗四周后結果表明運動組動脈壁cAMP水平增加19.2%，不運動組則降低49.4%；肝臟cAMP含量運動組與不運動組分別降低21.2%和15.7%，血漿cAMP濃度運動組與不運動組分別升高0.95%和6.8%。王澤軍等［14］研究表明游泳訓練可以使大鼠海馬cAMP濃度分別發(fā)生了顯著的升高。Bernabeu［15］在實驗中發(fā)現(xiàn)大鼠海馬cGMP水平在訓練后即刻達峰值，相反cAMP水平在3h后才達峰值。

本實驗把間歇運動和持續(xù)運動作為應激源對大鼠進行研究，該二者是兩種完全不同的運動：前者是一種極限強度并且嚴格控制運動和間歇時間的無氧訓練方法［16］，后者具有強度低、有節(jié)奏、持續(xù)時間較長的特點。通過六周的游泳訓練，結果顯示，不同游泳運動對大鼠海馬cAMP影響不同。二者雖然都呈鋸齒形特征，但變化規(guī)律相差甚遠。間歇運動組先升后降且幅度逐漸增大，運動后即刻與對照組相比略有上升，但無顯著差異 （p＞0.05），運動后30min cAMP濃度呈下降趨勢，有顯著性差異 （p＜0.01）；60min cAMP濃度略有上升，無顯著差異 （p＞0.05），運動后120min cAMP濃度呈下降趨勢，有顯著性差異 （p＜0.01）；運動后240min cAMP濃度達到峰值，有顯著性差異 （p＜0.01）。原因可能是由于長期的運動訓練刺激，使cAMP一PKA通路中的某些激素受體的適應能力增強所致。在cAMP／PKACREB信號通路中，活化的PKA催化亞基可以通過細胞內的轉位而接近底物蛋白CREB，使CREB磷酸化，調節(jié)轉錄因子的活性［17］，從而介導細胞對外界刺激 （如運動）的反應。而CREB作為核內 “第三信使”，被認為是對外部刺激產生適應以及長時記憶的最適合轉錄因子。磷酸化的CREB可以激活相關基因的轉錄，其中包括調節(jié)C-FOS以及通過Ca2＋依賴性的形式調節(jié) BDNF的表達［18－19］。間歇組cAMP濃度在240min達到峰值說明在這一時刻可能海馬的學習記憶能力得到了很大的提高。持續(xù)運動組先降后升，與對照組相比在即刻有所下降，有顯著差異 （p＜0.05）；運動后30 min略高于對照組，但無顯著差異性 （p＞0.05）；在60min達到最低值 （p＜0.01）；120min有所上升但仍低于對照組，240min略有下降，二者均有顯著差異 （p＜0.05）。持續(xù)組cAMP濃度只有在運動后30min略高于對照組且無明顯差異，其他時刻均低于對照組。其變化比較平緩可能和對運動的適應、cAMP的一過性等特點有關。有研究發(fā)現(xiàn)cRE BmRNA升高是在運動結束后第3d以及第7d，在第28d cREBmRNA水平并無顯著變化［20］?？傊?，不同運動方式（運動強度、運動時間、運動間歇等）對海馬cAMP濃度變化存在一定的時效性 （表達峰值、表達持續(xù)時間等）。

海馬cAMP濃度的變化和運動強度、運動時間、運動量有很大的關系［21］。疾病、運動、藥物等多種刺激因素均可引起神經細胞內cAMP濃度發(fā)生改變繼而引發(fā)后續(xù)各種反應［22－32］。研究不同運動方式對大鼠海馬cAMP濃度的影響，把體育鍛煉作為一種積極而有效的方法，可以為在學習記憶或腦功能方面有缺陷的患者提供一定的幫助，同時可以為制定運動處方提供實驗依據(jù)。細胞信號傳導過程極為復雜，多是通過多條信息轉導的分支與匯聚來實現(xiàn)的。cAMP的變化又是如何影響PKA、CREB等相關蛋白激酶和轉錄因子的，這些問題的提出與解決，有助于我們今后更深入的研究。究竟何種方式、強度及持續(xù)時間的運動對學習記憶的提高最適宜？這將是繼續(xù)研究的關鍵問題。

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The Experimental Study on the Effect of Different Swimming Ways on the Rat Hippocampus’s cAMP

ZHANG An-min1，ZHANG Rui-ping1，JIA Hui-juan2，WANG Peng-cheng1
（1.College of Physical Education，Yantai University，Yantai 264005，China；2.College of Physical Education，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

Objective：To observe the change of cAMP concentration in rat hippocampus after swimming and to explore different swimming ways’effect on the hippocampal cAMP.Methods：To establish a rat swimming model（continued swimming，intermittent swimming），using enzyme link immunosorbent method to observe the changes of hippocampal cAMP concentration，and use statistical software for data analysis.Results：After exercise the continued group and the intermittent group’s cAMP concentration all appeared the shape of sawteeth，but there are significant differences in variation.Continued group falls first and then rises，compared with the control group，it declines in the immediate，60min，120min，240min，there are significant differences（p＜0.05）；in 60min it reaches the minimum （p＜0.01）；slightly higher than the control group 30min after exercise，there was no significant difference（p＞0.05）.The intermittent group increases first and then decreases gradually and the magnitude changes，as compared with the control group，the cAMP concentration reaches its peak 240min after exercise，there is a significant difference（P＜0.01）；and 30min，120min after exercise，cAMP concentration is in a downward trend，there was a significant difference（P＜0.01）；The cAMP concentration increases slightly immediately after exercise，60min，there is no significant difference（p＞0.05）.Conclusion：Different ways of swimming have different impact on hippocampal cAMP and it has a certain timeliness.

hippocampus；second messenger cAMP；endurance swimming；intermittent swimming

G804.7

A

1008-3596（2011）06-0078-05

2011-08-10

國家自然科學

（30671019）；山東省自然科學基金項目（Y2008c29）

張安民 （1959－），男，山西萬榮人，教授，研究方向為運動醫(yī)學。