孫穎穎，張靜，劉泓君，李燦，王長海

(1.淮海工學院 江蘇省海洋生物技術重點建設實驗室, 江蘇 連云港 222005; 2.煙臺大學 海洋學院，山東 煙臺264005)

龍須菜對3種赤潮微藻生長的影響

孫穎穎1，張靜1，劉泓君1，李燦1，王長海2

(1.淮海工學院 江蘇省海洋生物技術重點建設實驗室, 江蘇 連云港 222005; 2.煙臺大學 海洋學院，山東 煙臺264005)

在共生條件下，研究了鮮龍須菜對前溝藻、米氏凱倫藻和塔瑪亞歷山大藻等3種赤潮微藻生長的影響。在此基礎上，以龍須菜培養(yǎng)水過濾液和龍須菜水溶性抽提液為實驗用液，分析它們對上述3種赤潮微藻的抑制作用。最后，采用甲醇浸泡龍須菜干粉末，研究了其甲醇提取物對3種赤潮微藻生長的影響。結果表明，當鮮龍須菜濃度≥ 32 g·L-1時，其能顯著抑制3種赤潮微藻的生長，對它們的生長抑制率在42%以上。在龍須菜（濃度為32 g·L-1）培養(yǎng)水過濾液的實驗中，發(fā)現(xiàn)無論一次性還是在半連續(xù)添加方式，培養(yǎng)水過濾液都對3種赤潮微藻表現(xiàn)出較為明顯的抑制作用；同時發(fā)現(xiàn)，40～80℃下處理此培養(yǎng)水過濾液，其抑藻作用并未顯著減弱，可見龍須菜抑藻物質有較高的熱穩(wěn)定性。當龍須菜水溶性抽提液濃度為16 g·L-1時，其顯著了抑制3種赤潮微藻的生長。龍須菜干粉末的甲醇提取物同樣能顯著抑制3種赤潮微藻的生長，在甲醇提取物濃度為2.0 g·L-1時，對3種赤潮微藻的生長抑制率超過40%。上述結果表明，抑藻物質不僅存在于鮮龍須菜中，還存在于其干粉末中。

龍須菜；抑藻物質；赤潮微藻

研究表明，海藻不僅能夠凈化水質，還能與赤潮微藻進行營養(yǎng)競爭[1]，防止赤潮生物的爆發(fā)性繁殖與增長；同時，它們還能向環(huán)境中分泌抑藻物質，抑制赤潮微藻的生長[2-4]。目前，海藻抑制微藻的研究正在逐漸深入，已經發(fā)現(xiàn)某些海藻對微藻生長的抑制作用。例如，孔石莼（Ulva pertusa）抑制赤潮異彎藻（Heterosigma akashiwo）和塔瑪亞歷山大藻（Alexandrum tamarense）[4]，龍須菜（Gracilaria lemaneiformis）抑制錐狀斯氏藻（Scrippsiella trochoidea）[5]、東海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）和塔瑪亞歷山大藻[6]、鼠尾藻（Surgassum thunbergii）和小珊瑚藻（Corallina pilulifera）抑制赤潮異彎藻[7,8]。鑒于此，本文選定龍須菜（Gracilaria lemaneiformis）為材料，采用共培養(yǎng)方法，研究了鮮龍須菜、龍須菜培養(yǎng)水過濾液和其水溶性抽提液對前溝藻（Amphidinium hoefleri）、米氏凱倫藻（Karenia mikimitoi）和塔瑪亞歷山大藻（Alexandrium tamarense）等3種赤潮微藻生長的影響。在此基礎上，采用甲醇浸泡龍須菜干粉末，分析龍須菜甲醇提取物對上述3種微藻生長的抑制作用，以期為利用海藻防控赤潮提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

前溝藻、米氏凱倫藻和塔瑪亞歷山大藻無菌株由中國海洋大學提供。

龍須菜取自福建沿海，蒸餾水沖洗后，用混合抗生素對藻體作滅菌處理，再用滅菌海水漂洗3～4次，無菌培養(yǎng)于f /2培養(yǎng)液中，溫度23±1℃，光強3 000 lx，光暗比16︰8。

天然海水經過脫脂棉和300目篩絹過濾，煮沸、冷卻，pH 值和鹽度分別調節(jié)至8.5和30備用（本文所用海水均做此處理）。

1.2 鮮龍須菜的抑藻實驗

將指數(shù)生長期的微藻與鮮龍須菜同時接種于500 mL錐形瓶，內裝200 mL f/2培養(yǎng)液。龍須菜濃度分別為0 g·L-1、4 g·L-1、8 g·L-1、16 g·L-1、32 g·L-1和64 g·L-1，前溝藻、米氏凱倫藻和塔瑪亞歷山大藻的接種密度依次為9×104mL-1、9×104mL-1和8 ×104mL-1，每個錐形瓶設3個重復。在光照培養(yǎng)箱內培養(yǎng)12 d，溫度23±1℃，光強3 000 lx，光暗比16︰ 8（如未特別說明，后續(xù)實驗培養(yǎng)條件相同）。每隔1日取樣1 mL，用Lugol’s試劑固定后，測定藻細胞密度。同時，取樣后向培養(yǎng)瓶中加入1 mL 200倍f/2培養(yǎng)液，以維持培養(yǎng)液體積恒定。

1.3 龍須菜培養(yǎng)水過濾液的抑藻實驗

1.3.1 一次性培養(yǎng) 32 g·L-1鮮龍須菜培養(yǎng)在f/2培養(yǎng)液內，同時設定未培養(yǎng)龍須菜的空白錐形瓶（僅f/2培養(yǎng)液），每個錐形瓶設定3個重復。4d后移去龍須菜，培養(yǎng)液經高溫滅菌的0.22 μm濾膜過濾。過濾液重新配制為f/2培養(yǎng)液，接種3種微藻。未培養(yǎng)龍須菜f/2培養(yǎng)液按照同樣方法處理后，接種微藻，作為對照。

1.3.2 半連續(xù)培養(yǎng) 在數(shù)個培養(yǎng)缸內（內裝f/2培養(yǎng)液）接種32 g·L-1鮮龍須菜，培養(yǎng)缸分為A和B 2組。4d后，移出A組培養(yǎng)缸內龍須菜，按照上述方法制備龍須菜培養(yǎng)水的過濾液，配制為f/2培養(yǎng)液后，用于3種微藻的培養(yǎng)。同時，將3種微藻分別接種于新鮮海水配制的f/2培養(yǎng)液中作為對照，每個錐形瓶內培養(yǎng)液總體積為200 mL。B組培養(yǎng)缸內的龍須菜繼續(xù)培養(yǎng)，并為半連續(xù)培養(yǎng)供給龍須菜培養(yǎng)水過濾液。

每日從每個錐形瓶移取50 mL藻液，同時加入50 mL龍須菜培養(yǎng)水過濾液（來自于B組，并按照上述方法處理后，重新配制為f/2培養(yǎng)液）。對照組按照同樣方法移取50 mL藻液，并加入50 mL新配制的f/2培養(yǎng)液。

1.3.3 溫度對龍須菜培養(yǎng)水抑制作用的影響將數(shù)個裝有100 mL龍須菜培養(yǎng)水的過濾液（按照上述實驗方法制備）的錐形瓶分別置于40、60和80℃的水浴中加熱，水浴時間60 min。待錐形瓶冷卻至室溫后，補充蒸餾水至100 mL，并將過濾液pH調為8.5，添加營養(yǎng)鹽配制為f/2培養(yǎng)液，同時設定新鮮海水和龍須菜培養(yǎng)水過濾液配制的f/2培養(yǎng)液分別為對照1和對照2，接種3種微藻。

1.4 龍須菜水溶性抽提液的抑藻實驗

48 g新鮮龍須菜研磨成漿后，加入滅菌海水，4 000g離心10 min，獲得300 mL水溶性抽提液，并配制為f/2培養(yǎng)液。然后，用新鮮海水配制的f/2培養(yǎng)液將其依次稀釋為2、4、8、16和32 g·L-1，用于前溝藻、米氏凱倫藻和塔瑪亞歷山大藻等3種微藻的培養(yǎng)。同時，將3種微藻接種于新鮮海水配制的f/2培養(yǎng)液中，作為對照。

在上述實驗基礎上，選定產生抑制作用濃度的水溶性抽提液。將此水溶性抽提液經高溫121℃高溫處理30 min。冷卻后，按照f/2培養(yǎng)液添加營養(yǎng)鹽后用于上述3種微藻的培養(yǎng)，同時以新鮮海水配制的f/2培養(yǎng)液培養(yǎng)微藻作為對照。

1.5 龍須菜甲醇萃取物的抑藻實驗

新鮮龍須菜40℃干燥，研磨成粉末（粉碎至0.3 mm），甲醇浸泡4d，用濾紙過濾除去殘渣。40℃減壓蒸干，獲得浸膏，稱其質量后，用二甲基亞砜（DMSO）定容至10 mL。在無菌條件下，濃縮液通過0.22 μm無菌有機系濾膜過濾，于4℃冰箱備用。

通過前期預實驗已發(fā)現(xiàn)DMSO投加比例＜ 1%對受試微藻的生長無影響，實驗投加比例均控制在此范圍內。移取一定體積此溶液添加到f/2培養(yǎng)液中，隨后接種微藻。最終，甲醇萃取物濃度分別為0.25、0.5、1.0、2.0和4.0 g·L-1，同時，添加相應體積的DMSO作為對照。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS11.5軟件包進行獨立樣本檢驗統(tǒng)計分析，P＜ 0.05為顯著性差異。

微藻的生長抑制率為：I =（ 1－N/N0）×100%，式中：N為處理組藻細胞數(shù)量（/×104mL-1）；N0為對照組藻細胞數(shù)量（/×104mL-1）。

2 結 果

2.1 共生條件下，鮮龍須菜對3種赤潮微藻生長的影響

圖1表明，在共生條件下，鮮龍須菜對前溝藻、米氏凱倫藻和塔瑪亞歷山大藻的生長抑制顯著（P＜0.05）并具有濃度效應。當鮮龍須菜濃度為16 g·L-1時，第12d其對前溝藻和米氏凱倫藻的生長抑制率在55%以上。對塔瑪亞歷山大藻而言，鮮龍須菜濃度 ≥ 32 g·L-1時，塔瑪亞歷山大藻生長被顯著（P＜0.05）抑制，生長抑制率超過42%（第12 d）。在實驗設定濃度范圍內，未見鮮龍須菜對3種赤潮微藻的致死現(xiàn)象。

圖 1 鮮龍須菜(■ 0, □ 4 g·L-1, ▲ 8 g·L-1, Δ 16 g·L-1, ● 32 g·L-1, ○ 64 g·L-1)對3種赤潮微藻生長的影響Fig.1 Effects of the fresh tissue (■ 0, □ 4 g·L-1, ▲ 8 g·L-1, Δ 16 g·L-1, ● 32 g·L-1, ○ 64 g·L-1) of G. lemaneiformis on the growth of three species of red tide microalgae

2.2 龍須菜培養(yǎng)水過濾液對3種赤潮微藻生長的影響

上述實驗結果表明，32 g·L-1新鮮龍須菜能顯著抑制3種赤潮微藻的生長。因此，在培養(yǎng)水過濾液實驗中將龍須菜接種密度設定為32 g·L-1。從圖2可以看出，無論在一次性還是在半連續(xù)添加方式下，龍須菜培養(yǎng)水過濾液對3種赤潮微藻的生長均有顯著（P＜ 0.05）抑制作用，第12d龍須菜培養(yǎng)水過濾液對3種赤潮微藻的生長抑制率均超過41%。比較還發(fā)現(xiàn)，半連續(xù)添加方式下龍須菜培養(yǎng)水過濾液對3種赤潮微藻生長的抑制作用比一次性添加要更為強烈。

在40～80℃范圍內處理龍須菜培養(yǎng)水過濾液，發(fā)現(xiàn)溫度對龍須菜培養(yǎng)水過濾液作用于3種赤潮微藻的生長的抑制作用并無明顯（P＞ 0.05）影響（圖3）。

圖 2 在一次性和半連續(xù)龍須菜培養(yǎng)水過濾液添加方式下3種赤潮微藻的生長曲線Fig.2 Growth curves of three species of red tide microagae under initial or semi-continuous culture medium filtrate addition of G. lemaneiformis

圖 3 溫度（■ 對照1，□ 對照2，▲ 40℃，Δ 60℃，● 80℃）對龍須菜培養(yǎng)水過濾作用于3種赤潮微藻生長的抑制作用的影響Fig.3 Effect of temperature (■ control 1，□ control 2，▲ 40℃，Δ 60℃，● 80℃) on the inhibitory activity of culture medium filtrate from G.lemaneiformis for the growth of three species of red tide microalgae

2.3 龍須菜水溶性抽提液對3種赤潮微藻生長的影響

較高濃度（16 g·L-1和32 g·L-1）的龍須菜水溶性抽提液能顯著（P＜ 0.05）抑制3種赤潮微藻的生長（圖4）。第12d，32 g·L-1龍須菜水溶性抽提液對3種的生長抑制率在62%以上。同時，當其濃度范圍在2～8 g·L-1時，龍須菜水溶性抽提液對前溝藻、米氏凱倫藻和塔瑪亞歷山大藻的生長并沒有明顯（P＞ 0.05）的影響。

2.4 龍須菜甲醇提取物對3種赤潮微藻生長的影響

在圖5中，當濃度超過1.0 g·L-1時，龍須菜甲醇提取物顯著（P＜ 0.05）抑制了米氏凱倫藻的生長，第12d，甲醇提取物對米氏凱倫藻的生長抑制率在60%以上。對前溝藻和塔瑪亞歷山大藻而言，當龍須菜甲醇提取物濃度 ≥ 2.0 g·L-1時，同樣顯著（P＜0.05）抑制了此2種微藻的生長。

圖 4 龍須菜水溶性抽提液(■ 0, □ 2 g·L-1, ▲ 4 g·L-1, Δ 8 g·L-1, ● 16 g·L-1, ○ 32 g·L-1)對3種赤潮微藻生長的影響Fig.4 Effects of aqueous extracts (■ 0, □ 2 g·L-1, ▲ 4 g·L-1, Δ 8 g·L-1, ● 16 g·L-1, ○ 32 g·L-1) of G.lemaneiformis on the growth of three species of red tide microalgae

圖 5 龍須菜甲醇提取物(■ 0, □ 0.25 g·L-1, ▲ 0.5 g·L-1, Δ 1.0 g·L-1, ● 2.0 g·L-1, ○ 4.0 g·L-1)對3種赤潮微藻生長的影響Fig.5 Effects of methanol extracts (■ 0, □ 0.25 g·L-1, ▲ 0.5 g·L-1, Δ 1.0 g·L-1, ● 2.0 g·L-1, ○ 4.0 g·L-1) of G.lemaneiformis on the growth of three species of red tide microalgae

3 討 論

本文選定我國沿海赤潮高發(fā)區(qū)常見赤潮微藻－前溝藻、米氏凱倫藻和塔瑪亞歷山大藻為實驗對象，分析龍須菜對它們生長的影響。共生條件下，鮮龍須菜（濃度為32 g·L-1）顯著抑制了前溝藻、米氏凱倫藻和塔瑪亞歷山大藻的生長（圖1）。研究表明，種群間的相互作用和相互競爭一般通過2種途徑進行：第一，細胞直接接觸抑制；第二，分泌某些物質。Uchida等指出，圓磷異囊藻（Heterocapsa circularisquama）對米氏裸甲藻（Gymnodinium mikimotoi）的抑制作用主要是通過細胞直接接觸[9]。顏天等認為，赤潮異彎藻對其它種群的抑制作用采取的是細胞直接接觸抑制[10]。因此，為了確定共生條件下，鮮龍須菜對前溝藻、米氏凱倫藻和塔瑪亞歷山大藻的抑制作用途徑，進行了龍須菜培養(yǎng)水過濾液的抑藻實驗。

圖2表明，龍須菜培養(yǎng)水過濾液一次性添加或半連續(xù)添加方式都對3種赤潮微藻的生長表現(xiàn)出一定的抑制作用，并且比較發(fā)現(xiàn)后者對3種赤潮微藻的抑制作用比前者更為強烈，這表明龍須菜釋放到培養(yǎng)基中的抑藻物質的數(shù)量相對較多（足以產生抑制作用），釋放方式是可連續(xù)性的，并且此抑藻物質可以在培養(yǎng)基中積累（應不屬于快速降解物質）。Nakai等也發(fā)現(xiàn)穗狀狐尾藻（Myriophyllum spicatum）通過連續(xù)分泌抑藻物質來抑制藍藻生長[11,12]。在條滸苔（Enteromorpha clathrata）與三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）研究中，王蘭剛等也認為鮮條滸苔持續(xù)向周圍環(huán)境中分泌抑藻物質，當此物質累計到一定濃度時會對共培養(yǎng)的微藻產生強烈抑制作用[13]。隨后，本文通過溫度處理實驗進一步證實，龍須菜釋放的抑藻物質具有較高的熱穩(wěn)定性（圖3），這為后續(xù)龍須菜抑藻物質的分離純化工作提供了很好的實驗基礎。

從圖4和圖5可知，不僅鮮龍須菜中含有抑藻物質，在其干粉末中同樣存在著抑藻物質。采用甲醇浸泡龍須菜干粉末后，其甲醇提取物（2.0 g·L-1）強烈地抑制了前溝藻、米氏凱倫藻和塔瑪亞歷山大藻等3種赤潮微藻的生長。這表明，后續(xù)工作中可利用甲醇進行龍須菜抑藻物質的初步分離。

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Effects of macroalgaGracilaria lemaneiformison the growth of three species of red tide microalgae under laboratory conditions

SUN Ying-ying1, ZHANG Jing1, LIU Hong-jun1, LI Can1, WANG Chang-hai2

(1.Jiangsu key laboratory of marine biotechnology, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China; 2.School of Ocean, Yantai University, Yantai 264005, China)

To study the effects of freshGracilaria lemaneiformison the growth of the three species of red tide microalgae (Amphidinium hoefleri,Karenia mikimitoiandAlexandrium tamarense), those microalgae coexist with different initial inoculation concentrations of fresh tissue ofG.lemaneiformis, respectively.Furthermore, the inhibitory activities against three species of red tide microalgae of freshG.lemaneiformis’s culture filtrate and aqueous extracts ofG.lemaneiformiswere tested.The extracts were extracted from the dry powder ofG.lemaneiformiswith methanol, and to probe their inhibitory effects on the growth of those microalgae.The results showed that the fresh tissue ofG.lemaneiformishad strong growth inhibitory effect onA.hoefleri,K.mikimitoiandA.tamarenseat the concentration of 32 g·L-1and the growth inhibitory for three species of red tide microalgae was above 42%.The culture medium filtrate ofG.lemaneiformis(the concentration of 32 g·L-1) could significantly inhibit the growth of the three species of the red tide microalgae under initial or semi-continuous filtrate addition.The further investigation found that the culture medium filtrate ofG.lemaneiformisthat had gentle heat for 60 minutes under different lengths of temperature (40℃, 60℃ and 80℃) also had significant inhibitory effect on the growth of all test microalgae; this suggested that the inhibitory substances had higher thermal stability.The growth of all test microalgae was restrained by freshG.lemaneiformis’s aqueous extracts when concentration was 16 g·L-1.The methanol extracts ofG.lemaneiformisdry powder also inhibited significantly those three species of red tide microalgae at the concentration of 2.0 g·L-1, and the growth inhibitory for three species of red tide microalgae was above 40%.It indicated freshG.lemaneiformishad the inhibitory substances and inhibitory substances exited also inG.lemaneiformis’s dry powder.

Gracilaria lemaneiformis; inhibitory substances; red tide microalgae

Q949.2

A

1001-6932(2011)03-0328-06

2010-03-06 ；收修改稿日期：2010-10-07

江蘇省海洋生物技術重點建設實驗室開放課題（2009HS09）。

孫穎穎（1978-），女，黑龍江樺南人，博士，講師，主要從事海洋生化工程研究。電子郵箱：syy-999@163.com。