任 佳 鄭小平 黃菲菲 陳景春 馬穎清 樓 飛

（農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（上海），上海 200436）

UPLC－MS/MS法測定乳制品中的氯霉素類藥物

任 佳 鄭小平 黃菲菲 陳景春 馬穎清 樓 飛

（農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（上海），上海 200436）

建立超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC－MS/MS）法測定乳與乳制品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的檢測方法。樣品經(jīng)乙腈及乙酸乙酯提取、正己烷脫脂、C18柱凈化后，通過超高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測，內(nèi)標(biāo)法定量。各標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.1～10μg/L范圍內(nèi)呈線性相關(guān) （r＝0.999），不同基質(zhì)樣品中添加回收率為75%～114%，檢出限為0.1μg/kg。結(jié)果表明，該方法是一種準(zhǔn)確測定乳與乳制品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的檢測方法。

氯霉素；甲砜霉素；氟苯尼考；超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜；乳與乳制品

氯霉素類藥物是一種高效廣譜的抗生素，包括氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考等。氯霉素對人體具有毒副作用，能抑制造血機(jī)能，引發(fā)人體的粒細(xì)胞缺乏病、再生障礙性貧血和溶血性貧血［1］。因此，很多國家規(guī)定氯霉素的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)為“零容許量”，即不得檢出。中國農(nóng)業(yè)部235號公告規(guī)定鮮奶中不得檢出氯霉素，甲砜霉素殘留限量為50μg/kg。目前，針對水產(chǎn)品、蜂產(chǎn)品、動(dòng)物組織等基質(zhì)中氯霉素類藥物的檢測方法較多，主要有微生物法［2，3］、酶聯(lián)免疫法［4］、氣相色譜法［5，6］、液相色譜法［7］、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法［8，9］、液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法［10－12］等，但針對乳與乳制品中氯霉素類藥物的檢測方法較少。乳與乳制品如采用其他方法中較常使用的提取試劑乙酸乙酯直接提取，會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的乳化現(xiàn)象。這是由于蛋白質(zhì)與脂肪，尤其是脂肪具有乳化性，在進(jìn)行劇烈震蕩提取過程中容易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象。乳與乳制品的主要組成包括蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、維生素、無機(jī)鹽、水分等，這些樣品基質(zhì)的存在不但干擾待測物的檢測，而且會(huì)污染儀器和降低設(shè)備使用壽命，需要重新選擇合理有效的提取試劑。UPLC－MS/MS具有快速，高靈敏度和高專一性等特點(diǎn)，不受化學(xué)噪聲的干擾。本試驗(yàn)利用UPLC－MS/MS，旨在建立一種乳與乳制品中氯霉素類藥物的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

牛奶、奶粉、乳清粉：均為市售產(chǎn)品。

1.2 試劑

乙酸乙酯、乙腈：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

正己烷、甲醇：色譜純，西格瑪奧德里奇公司；

氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考（標(biāo)準(zhǔn)物）：純度＞99%，德國Dr.Ehrenstorfer公司；

氘代氯霉素（標(biāo)準(zhǔn)物）：100μg/mL，德國Dr.Ehrenstorfer公司。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取適量的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇配成100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。準(zhǔn)確吸取1mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于100mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，此混合溶液中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考濃度為1.0μg/mL。

氘代氯霉素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：準(zhǔn)確吸取100μL氘代氯霉素于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度。

1.3 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀：Quattro Premie，美國沃特世公司；

氮吹儀：ANPEL DC12，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；

SPE固相萃取柱：LC－C18，色譜科公司。

1.4 方法

1.4.1 樣品準(zhǔn)備

（1）液態(tài)奶：準(zhǔn)確稱取5g，置于15mL離心管中。

（2）奶粉、黃油、奶酪、乳清粉等乳制品：準(zhǔn)確稱取2g，置于15mL離心管中，用5mL水溶解，必要時(shí)可加熱溶解。

1.4.2 樣品中氯霉素類藥物的提取 準(zhǔn)確吸取氘代氯霉素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液50μL于裝有樣品的15mL離心管中，加入5mL乙腈，渦旋振蕩提取1min，以4 000r/min離心5min，上清液轉(zhuǎn)移至100mL燒杯，重復(fù)提取2次，合并上清液；加入10mL乙酸乙酯以及5g氯化鈉，渦旋振蕩提取1min，4 000r/min離心5min，棄下層水，收集的乙腈－乙酸乙酯混合溶液在50℃左右使用氮吹儀吹干；吹干后的提取物分別用4mL水、4mL正己烷溶解后轉(zhuǎn)移至15mL離心管，渦旋振蕩1min，以4 000r/min離心5min，棄上清液，用4mL正己烷重復(fù)提取1次，棄上清液，下層水溶液備用。

1.4.3 C18柱凈化處理 依次用3mL甲醇、3mL水活化，取備用液過柱，棄去流出液，用3mL水淋洗，減壓抽干，用3mL甲醇洗脫，收集洗脫液于離心管中，置于氮吹儀上50℃ 吹至近干，用1mL甲醇－水混合溶液（30＋70）溶解，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，試液供測定。

1.5 色譜和質(zhì)譜條件

1.5.1 UPLC條件 色譜柱：C18色譜柱，粒徑1.7μm，50mm ×2.1mm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10μL；流動(dòng)相：甲醇＋水 （30＋70）；流速：0.20mL/min。

1.5.2 串聯(lián)質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧負(fù)離子源；檢測方式：多反應(yīng)檢測（MRM）；毛細(xì)管電壓：2.5kV；離子源溫度：110℃；脫溶劑氣及錐孔氣：氮?dú)?，流量分別為700，50L/h；碰撞氣：氬氣；定性離子對、定量離子對及對應(yīng)的保留時(shí)間、錐孔電壓和碰撞能量見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系

將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋得到濃度為0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列。在規(guī)定的色譜條件下進(jìn)行測定，得到的線性方程見表2。由表2可知，在0.1～10μg/mL范圍之內(nèi)氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考濃度與色譜峰面積響應(yīng)值之間存在著良好的線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)溶液的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）圖譜見圖1。表明濃度為0.1μg/L時(shí)各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)響應(yīng)值良好。

表1 各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的多反應(yīng)監(jiān)測的參考值Table 1 The reference value in multiple reaction monitoring of each standard material

表2 標(biāo)準(zhǔn)溶液回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 2 Regression equation and the correlation coefficient of the standard solution

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖Figure 1 MRM chromatogram of standard solution

2.2 準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn)

選取牛奶、奶粉、乳清粉三類典型樣品，進(jìn)行氯霉素類抗生素添加回收試驗(yàn)，每個(gè)水平進(jìn)行6次平行測定，測定數(shù)據(jù)見表3。牛奶空白樣品及加標(biāo)回收樣品MRM色譜圖見圖2和圖3。

表3 不同樣品中平均加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The recovery and RSDof different samples（n＝6）

圖2 牛奶空白樣品MRM色譜圖Figure 2 MRM chromatogram of milk blank sample

圖3 牛奶加標(biāo)（0.1μg/kg）樣品 MRM 色譜圖Figure 3 MRM chromatogram of milk standard sample

由表3可知，按已確定的樣品提取條件和儀器條件測定添加回收量，其平均回收率達(dá)到75%～114%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差＜10%，說明該方法對不同樣品、不同含量的氯霉素類藥物的測定均有較好的準(zhǔn)確度和精密度。由圖2、3可知，添加濃度為0.1μg/kg時(shí)各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)響應(yīng)值良好，證明該方法靈敏度高，能滿足檢測條件。

2.3 檢出限

根據(jù)限量檢測要求，對牛奶、奶粉兩種典型樣品進(jìn)行氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考加標(biāo)回收重復(fù)試驗(yàn)，見表3。當(dāng)添加濃度為0.1μg/kg時(shí)，信噪比S/N＝6.7＞3，試驗(yàn)結(jié)果表明，氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考檢出限為0.1μg/kg。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定乳與乳制品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的檢測方法。采用乙腈、乙酸乙酯提取樣品中的氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考，正己烷去脂，C18柱凈化后通過液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行檢測，內(nèi)標(biāo)法定量各標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.1～10μg/L范圍內(nèi)呈線性相關(guān) （r＝0.999），區(qū)不同基質(zhì)樣品中添加回收率為75%～114%。與其他的檢測方法相比，本方法在前處理上，易于操作，可完全消除乳化影響；適用范圍廣，可適用于乳與乳制品（包括液態(tài)奶、乳粉、乳清粉、奶酪等）中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的檢測；靈敏度高，檢出限可達(dá)到0.1μg/kg，完全滿足乳制品進(jìn)出口檢測的需要。表明本試驗(yàn)提出的方法能準(zhǔn)確測定乳與乳制品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的含量。

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Determination of chloramphenicol，thiamphenicol and florfenicol residues in milk and dairy products by UPLC－MS/MS

REN Jia ZHENG Xiao－ping HUANG Fei－fei CHEN Jing－chun MA Ying－qingLOU Fei

（Food Quality Supervision and Testing Center of Ministry of Agriculture，Shanghai200436，China）

A method of determination of chloramphenicol，thiamphenicol and florfenicol in milk and dairy products by Ultra Performance Liquid Chromatography－Tandem Mass Spectrometry （UPLC－MS/MS）was developed .Samples were extracted with acetonitrile and ethyl acetate，and defatted with hexane.Through clean－up with C18column，Samples were detected by UPLC－MS/ MS.The method had a good linear relativity（r：0.999）between 0.1～10μg/L.Recovery rates in different substrate samples range from 75%to 114%，with LOD of 0.1μg/kg.The method was accurate and suitable for the quantification and confirmation of chloramphenicol，thiamphenicol and florfenicol in milk and dairy products.

chloramphenicol；thiamphenicol；florfenicol；UPLC－ MS/MS；milk and dairy products

10.3969 /j.issn.1003－5788.2011.04.020

上海市技術(shù)性貿(mào)易措施應(yīng)對專項(xiàng)（編號：2008TBT012）

任佳（1984－），女，農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心工程師，碩士。E－mail：renjia1102＠hotmail.com

鄭小平

2011－03－30