曹小彥 彭新凱 汪 輝 胡朝暉 黎 瑛 夏延斌

（1.長(zhǎng)沙市食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測(cè)中心，湖南 長(zhǎng)沙 410013；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

三聚氰胺在不同流動(dòng)相體系中的紫外吸收光譜

曹小彥1，2彭新凱1汪 輝1胡朝暉1黎 瑛1夏延斌2

（1.長(zhǎng)沙市食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測(cè)中心，湖南 長(zhǎng)沙 410013；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

研究三聚氰胺在不同流動(dòng)相中的紫外吸收情況。結(jié)果表明：三聚氰胺在不同溶劑中的紫外吸收不同，使用不同流動(dòng)相測(cè)定三聚氰胺時(shí)，應(yīng)選取相對(duì)應(yīng)的檢測(cè)波長(zhǎng)。在沒有檸檬酸體系的流動(dòng)相中應(yīng)采用203nm左右或236nm左右的檢測(cè)波長(zhǎng)；而在有檸檬酸體系的流動(dòng)相中應(yīng)采用236nm左右的檢測(cè)波長(zhǎng)。

三聚氰胺；流動(dòng)相；紫外吸收光譜；色譜

2007年美國(guó)發(fā)生的許多貓狗寵物非正常死亡事件（美國(guó)FDA經(jīng)過調(diào)查確認(rèn)是寵物食品的原料受非法添加的三聚氰胺污染，原料來自中國(guó)）和2008年“三鹿奶粉”事件引起了極大的社會(huì)反響。三聚氰胺即蜜胺（結(jié)構(gòu)式見圖1），又稱氰尿酰胺，白色晶體，相對(duì)密度1.573（250℃），熔點(diǎn)354℃，難溶于水、乙二醇、甘油和吡啶，略溶于乙醇，不溶于乙醚、苯和四氯化碳［1］。它是一種非食品添加劑，之所以被加入至食品中是因?yàn)槿矍璋泛扛哌_(dá)66.7%，可以增加食品的含氮量，冒充高蛋白食品，從而大幅度降低成本。而目前常用來檢測(cè)蛋白質(zhì)的“凱氏定氮法”，檢測(cè)飼料和食品中的粗蛋白質(zhì)的含量，其實(shí)只是檢測(cè)氮的含量，再根據(jù)蛋白質(zhì)的含氮量（15%～17%）折算成蛋白質(zhì)的含量，因此無法區(qū)分真假蛋白質(zhì)。

圖1 三聚氰胺結(jié)構(gòu)式Figure 1 The configuration of melamine

目前國(guó)內(nèi)外測(cè)定食品中三聚氰胺含量的方法一般采用液相色 譜 法［2－4］、液 相 － 質(zhì) 譜 法［5，6］、氣 相 － 質(zhì) 譜 法［7］等。HPLC－UV色譜法是研究和鑒定三聚氰胺的最有效的方法之一。對(duì)不同流動(dòng)相體系的紫外吸收光譜的研究是HPLC－UV色譜法的理論基礎(chǔ)，通過研究不同流動(dòng)相體系的紫外吸收光譜，為找出相對(duì)應(yīng)的檢測(cè)波長(zhǎng)，提高靈敏度，降低檢出限提供理論指導(dǎo)。但國(guó)內(nèi)外關(guān)于三聚氰胺在不同流動(dòng)相體系中的紫外吸收光譜的研究還未見報(bào)道。溶劑是影響三聚氰胺紫外吸收光譜的重要因素，本試驗(yàn)通過對(duì)三聚氰胺在不同流動(dòng)相中的紫外吸收的研究，找出在有無檸檬酸體系的流動(dòng)相中的最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

高效液相色譜儀（配VWD檢測(cè)器）：Agilent 1200，美國(guó)安捷倫科技有限公司；

雙光束紫外可見分光光度儀：TU－1900，北京普析通用儀器有限公司。

1.2 主要試劑

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品：＞99.5%，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；

庚烷磺酸鈉，乙腈，甲醇，辛烷磺酸鈉：均為色譜純；

檸檬酸，硫酸銨，磷酸二氫鉀：均為分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

根據(jù)中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB／T 22388——2008）［2］及參考文獻(xiàn)［8］中高效液相色譜法測(cè)定三聚氰胺含量所采用的不同流動(dòng)相和三聚氰胺在不同溶劑中的溶解情況，精確稱取一定量的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，分別用流動(dòng)相定容（見表1），配置成濃度為5μg／mL的三聚氰胺溶液，在TU－1900雙光束紫外可見分光光度儀中進(jìn)行分析，依次對(duì)各樣品在190～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外波長(zhǎng)掃描，狹縫寬度為0.5nm，石英比色皿厚度為1cm，用相對(duì)應(yīng)的空白溶劑作參比。

表1 流動(dòng)相與對(duì)應(yīng)的檢測(cè)波長(zhǎng)Table 1 Mobile phase and corresponding determination wavelengh

HPLC的操作方法均采用相對(duì)應(yīng)中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)［2］及參考文獻(xiàn)［3－8］所述方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 三聚氰胺在不同溶劑中的紫外吸收

配置三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液常用的溶劑是甲醇、乙腈、水、甲醇－水、乙腈－水。試驗(yàn)考查了相同濃度的三聚氰胺在水、甲醇－水（70＋30）、乙腈－水（70＋30）、乙腈和甲醇5種溶劑中的紫外光譜（見圖2）。

圖2 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的紫外吸收光譜Figure 2 Ultraviolet absorption spectral of melamine standard solution

由圖2可知，在所考查的5種不同極性溶劑中，三聚氰胺的紫外吸收光譜形狀基本一致，吸收峰最大移動(dòng)僅2nm，說明這5種溶劑對(duì)三聚氰胺的紫外吸收的影響較小。但在以水作為溶劑的三聚氰胺譜圖中，在203nm與235nm處最大吸收峰強(qiáng)度相對(duì)另外4種溶劑較大。因此建議配制三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)使用溶液時(shí)以水作溶劑較為合適。

2.2 三聚氰胺在不同流動(dòng)相中的紫外吸收

三聚氰胺在不同流動(dòng)相的紫外可見光譜（見圖3，流動(dòng)相同表1）。最大吸收光譜波長(zhǎng)主要與分子中共軛雙鍵的長(zhǎng)度及生（助）色基團(tuán)有關(guān)。從圖3可以看出，用不同流動(dòng)相溶解三聚氰胺時(shí)，三聚氰胺紫外吸收波長(zhǎng)有一定的相似性，在236.0nm附近都有吸收。這是因?yàn)槿矍璋罚瑿═N－雙鍵組成的六元環(huán)共軛結(jié)構(gòu)，n→π＊躍遷和六元環(huán)的振動(dòng)的重疊引起的，使得其吸收帶紅移［9－11］。

圖3 不同流動(dòng)相對(duì)三聚氰胺紫外吸收光譜的影響Figure 3 The infection of ultraviolet absorption spectral of melamine by different mobile phase

由于三聚氰胺目前的檢測(cè)方法多為液相色譜法，因此需要考查不同色譜流動(dòng)相中三聚氰胺的紫外吸收光譜，為選擇合適的色譜條件提供指導(dǎo)。

2.2.1 不同流動(dòng)相體系對(duì)三聚氰胺紫外吸收的影響 三聚氰胺在不同流動(dòng)相中的紫外吸收波長(zhǎng)不完全相同。這主要分兩個(gè)體系：① 有檸檬酸的流動(dòng)相體系；② 無檸檬酸的流動(dòng)相體系。無檸檬酸的流動(dòng)相體系基本遵循三聚氰胺各官能團(tuán)的紫外吸收原則，最大吸收波長(zhǎng)在205nm附近。有檸檬酸的流動(dòng)相體系由于檸檬酸本身的紫外吸收（見圖4），使三聚氰胺的低波長(zhǎng)吸收峰紅移［11］。

圖4 檸檬酸和離子對(duì)試劑的紫外吸收光譜Figure 4 The infection of ultraviolet absorption spectral of citric acid and different ion reagent

2.2.2 離子對(duì)試劑對(duì)三聚氰胺紫外吸收的影響 在有檸檬酸體系的流動(dòng)相中，對(duì)不同離子對(duì)試劑（相同濃度己烷磺酸鈉、庚烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉）對(duì)三聚氰胺紫外吸收光譜影響作了研究，發(fā)現(xiàn)離子對(duì)試劑對(duì)三聚氰胺紫外吸收影響甚微（見圖5）；同時(shí)分別在有檸檬酸的流動(dòng)相體系中改變庚（辛、己）烷磺酸鈉濃度為0.010，0.005，0.001mol／L（見圖6），發(fā)現(xiàn)其濃度變化對(duì)三聚氰胺紫外吸收影響小，僅低波長(zhǎng)吸收峰隨著離子對(duì)濃度的增加發(fā)生微小的增色效應(yīng)。

圖5 離子對(duì)試劑對(duì)三聚氰胺的紫外吸收光譜影響Figure 5 The infection of ultraviolet absorption spectral of melamine by different ion reagent

2.2.3 檸檬酸對(duì)三聚氰胺紫外吸收的影響 在有檸檬酸體系的流動(dòng)相中，三聚氰胺的紫外吸收光譜又隨檸檬酸濃度發(fā)生變化。本試驗(yàn)分別在檸檬酸體系的流動(dòng)相體系中改變檸檬酸濃度為0.010，0.005，0.001mol／L（見圖7）。隨著檸檬酸濃度增大，三聚氰胺低波長(zhǎng)吸收峰紅移程度越大，相對(duì)高吸收波長(zhǎng)卻無明顯變化。

另外，還參照文獻(xiàn)［11］所提供的色譜條件，有針對(duì)性的選取了幾個(gè)波長(zhǎng)，用高效液相色譜法作了比較。當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為203，205，210nm時(shí)，有檸檬酸的流動(dòng)相體系則由于基線干擾非常大，靈敏度低，檢測(cè)限值高（見圖8）；而無檸檬酸的流動(dòng)相體系則基線平穩(wěn)，靈敏度高，檢測(cè)限值低，能達(dá)到0.01mg／kg（見圖9）；當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm時(shí)，各流動(dòng)相響應(yīng)相當(dāng)；當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為236nm和240nm時(shí)，各流動(dòng)相幾乎都有相應(yīng)的響應(yīng)值，但檢測(cè)限值最低為2mg／kg。選擇適合自己的流動(dòng)相體系，除檢測(cè)限外，還應(yīng)從成本、做樣過程中受干擾程度和流動(dòng)相對(duì)儀器影響程度等因素綜合考慮。因此，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況來選擇合適的色譜條件。

圖6 離子對(duì)試劑濃度對(duì)三聚氰胺的紫外吸收光譜影響Figure 6 The infection of ultraviolet absorption spectral of melamine by the concentration of ion reagent

圖7 檸檬酸濃度對(duì)三聚氰胺的紫外吸收光譜影響Figure 7 The infection of ultraviolet absorption spectral of melamine by the concentration of citric acid

圖8 三聚氰胺色譜圖（有檸檬酸的流動(dòng)相體系，203nm，2mg／L）Figure 8 The chromatogram of melamine（in citric acid mobile phase system，203nm，2mg／L）

圖9 三聚氰胺色譜圖（無檸檬酸的流動(dòng)相體系，203nm，2mg／L）Figure 9 The chromatogram of melamine（in non－citric acid mobile phase system，203nm，2mg／L）

3 討論

從試驗(yàn)的結(jié)果可以看出，三聚氰胺在不同流動(dòng)相中紫外吸收波長(zhǎng)是不同的?？梢?，根據(jù)溶解三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品的某一種溶劑的掃描結(jié)果是很難確定三聚氰胺的吸收波長(zhǎng)的；況且在色譜分析過程中，通常采用一種以上的溶劑作為流動(dòng)相，其中的多種小分子與三聚氰胺分子相互作用也會(huì)影響三聚氰胺的紫外吸收。這就要求更加全面掌握三聚氰胺在不同流動(dòng)相中波長(zhǎng)的變化，才能找到適合各自色譜條件的檢測(cè)波長(zhǎng)。

綜上所述，采用高效液相色譜法測(cè)定三聚氰胺含量時(shí)，在沒有檸檬酸體系的流動(dòng)相中應(yīng)采用203nm左右或236nm左右的檢測(cè)波長(zhǎng)；而在有檸檬酸體系的流動(dòng)相中應(yīng)采用236nm左右的檢測(cè)波長(zhǎng)。

1 王箴.化工辭典［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000.

2 中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì).GB／T 22388——2008原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

3 汪輝，曹小彥，彭新凱，等.高效液相色譜－二極管陣列法測(cè)定高蛋白食品中的三聚氰胺［J］.食品與機(jī)械，2007，23（5）：114～124.

4 汪輝，彭新凱，曹小彥，等.高效液相色譜測(cè)定生鮮乳及乳制品中三聚氰胺的方法研究［J］.食品科學(xué)，2008，29（10）：531～535.

5 丁濤，徐錦忠，李健忠，等.高效液相色譜－二極管陣列檢測(cè)法及高效液相色譜－電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定植物源性蛋白中殘留的三聚氰胺［J］.色譜，2008，26（1）：6～9.

6 賴碧清，鄭曉航，韓銀濤.高效液相色譜－四極桿質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定飼料中三聚氰胺含量［J］.飼料工業(yè)，2008，29（4）：47～48.

7 蔣晨陽，范倩，林德清，等.氣質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定飼料中的三聚氰胺［J］.飼料工業(yè)，2008，29（8）：48～50.

8 張俊燕，何呂興.三聚氰胺的樣品前處理及最新檢測(cè)方法［J］.生命科學(xué)儀器，2007，5（10）：57～59.

9 楊勝科，張金平，徐永花，等.蘇丹Ⅲ在不同溶劑中的紫外可見光譜研究［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2007，27（2）：325～328.

10 Gilchrist T L.Heterocyclic Chemistry［M］.2nd ed.New York：Wiley，1992.

11 朱明華.儀器分析［M］.北京：高等教育出版社，2000：270～278.

Ultraviolet absorption spectral of melamine in different mobile phase

CAO Xiao－yan1，2PENG Xin－kai1WANG Hui1HU Zhao－h(huán)ui1LI Ying1XIA Yan－bing2

（1.Changsha Center of Supervision ＆Inspection on Food Quality Safety，Changsha，Hunan410013，China；2.College of Food Science and Technology，Hunan Agriculture University，Changsha，Hunan410128，China）

Ultraviolet absorption spectral of melamine in different mobile phase was studied.The result showed there was different ultraviolet absorption spectral of melamine in different solvents and determination content of melamine in different mobile phase must chose corresponding check wavelength.Finally，wavelength in 203nm or 236nm was chose in none citric acid system and while with wavelength about 236nm in citric acid system.

melamine；mobile phase；ultraviolet absorption spectral；chromatogram

10.3969／j.issn.1003－5788.2011.04.017

曹小彥（1973－），女，長(zhǎng)沙市食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測(cè)中心高級(jí)工程師，在讀博士。E－mail：caoxiaoye＠163.com

2011－04－01