唐琪，孫向英，李芳

（華僑大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，福建 泉州 362021）

陰離子聚電解質(zhì)誘導(dǎo)硫代黃素T激基締合物的形成因素分析

唐琪，孫向英，李芳

（華僑大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，福建 泉州 362021）

研究在水溶液中陰離子聚電解質(zhì)聚乙烯磺酸鈉（PVS）誘導(dǎo)陽(yáng)離子型染料硫代黃素T（ThT）激基締合物的形成，考察在PVS存在下，ThT在水溶液中形成激基締合物的影響因素.通過(guò)光譜實(shí)驗(yàn)及量化理論計(jì)算方法，比較ThT與PVS，PSS和PAA聚電解質(zhì)之間的相互作用.結(jié)果表明：溶液pH值、溶劑和電解質(zhì)的濃度對(duì)ThT激基締合物的形成均有顯著的影響；PSS，PVS可誘導(dǎo)ThT形成激基締合物，而PAA則無(wú)法誘導(dǎo)形成締合物；通過(guò)靜電吸引作用，PVS可以增加ThT的局部濃度，從而顯著地促進(jìn)ThT激基締合物的形成.

硫代黃素T；激基締合物；熒光分析；聚電解質(zhì)；量子化學(xué)

O 631.3；O 657.3

A

激基締合物［1-2］是指一個(gè)處于基態(tài)的熒光團(tuán)和另一個(gè)處于激發(fā)態(tài)且具有同樣結(jié)構(gòu)的熒光團(tuán)之間發(fā)生相互作用形成的復(fù)合物 .在大多數(shù)情況下，可以觀測(cè)到單體和激基締合物的雙重?zé)晒獍l(fā)射峰.激基締合物特有的發(fā)光特征可用作探針，在一些科學(xué)研究中已經(jīng)獲得應(yīng)用［3-5］.由于激基締合物的形成或破壞所引起的光譜行為變化是其作為探針應(yīng)用的重要依據(jù)，所以研究激基締合物形成的基本條件和有關(guān)的熱力學(xué)數(shù)據(jù)，對(duì)其充分發(fā)揮探針的作用是十分重要的.聚電解質(zhì)［6-11］是指主鏈或側(cè)鏈帶有可電離基團(tuán)的高分子，在水溶液或強(qiáng)極性溶劑中可電離為聚離子和反離子，由于分子鏈上電離基團(tuán)之間強(qiáng)的長(zhǎng)程靜電相互作用，導(dǎo)致其有許多與中性高分子不同的特性.硫代黃素T（ThT）是一種陽(yáng)離子熒光試劑，多用于檢測(cè)DNA和淀粉質(zhì)體［12-14］.本文研究水溶液中聚陰離子電解質(zhì)聚乙烯磺酸鈉（PVS）誘導(dǎo)陽(yáng)離子型染料硫代黃素T激基締合物的形成，并考察PVS存在下，ThT在水溶液中形成激基締合物的影響因素.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑

硫代黃素T（ThT，比利時(shí)Acros公司），聚苯乙烯磺酸鈉（PSS，比利時(shí)Acros公司）；聚乙烯磺酸鈉（PVS，北京百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司），聚丙烯酸（PAA，北京百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為Milli－Q基礎(chǔ)型（美國(guó)Millipore公司）純化水系統(tǒng)提供的二次水.

1.2 儀器

Cary Eclipse型熒光分光光度計(jì)（美國(guó)Varian公司）；UV－2102PC型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)（美國(guó)Unico公司）.

2 結(jié)果與討論

2.1 硫代黃素T濃度對(duì)其熒光光譜的影響

取一系列10mL的比色管，各加入1.00mL的10.0mmol·L－1的硫代黃素T 溶液和不同體積的0.10mg·L－1聚陰離子電解質(zhì)（PVS，PSS和PAA），定容到10mL.固定熒光激發(fā)波長(zhǎng)為335nm，狹縫為5.0nm／10nm，分別掃描ThT溶液在熒光池中的熒光光譜，如圖1所示.由圖1可見(jiàn)：硫代黃素T熒光強(qiáng)度（I）隨硫代黃素T濃度的變大先增大后減小，在0.100mmol·L－1時(shí)熒光強(qiáng)度達(dá)到最大.ThT熒光光譜隨著自身濃度的增大發(fā)生紅移，形成二聚體，但是始終沒(méi)有激基締合物的熒光峰出現(xiàn).

不同濃度硫代黃素T的紫外可見(jiàn)吸收光譜曲線，如圖2所示 .圖2中：D為光密度 .從圖2可知：低濃度時(shí)，ThT主要以單體形式存在，在412nm處有吸收峰；隨著ThT濃度的增大，在255nm處出現(xiàn)明顯的吸收峰，該峰可能歸屬于硫代黃素T二聚體的形成.412nm處的特征吸收峰強(qiáng)度隨著ThT溶液濃度的增大而增強(qiáng).

圖1 不同濃度ThT水溶液的熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectra of ThT aqueous solution with different concentration

圖2 不同濃度ThT水溶液的紫外可見(jiàn)吸收光譜 Fig.2 Ultraviolet－visible absorption spectra of ThT aqueous solution with different concentration

2.2 PVS誘導(dǎo)ThT激基締合物的形成

在1.00mmol·L－1的ThT各溶液中加入不同濃度的聚乙烯磺酸鈉（PVS）溶液，穩(wěn)定后測(cè)定溶液的熒光光譜，如圖3所示.從圖3可知：當(dāng)ThT水溶液沒(méi)有PVS時(shí)，ThT主要以二聚體形式存在，熒光發(fā)射峰λem＝484nm；加入少量PVS引起二聚體熒光強(qiáng)度降低，同時(shí)在長(zhǎng)波長(zhǎng)方向出現(xiàn)一個(gè)新的相對(duì)較寬的激基締合物的熒光發(fā)射峰（λem＝556nm）.此外，隨著PVS濃度的增加，484nm處的二聚體熒光峰強(qiáng)度逐漸減弱后不變，556nm處的激基締合物熒光峰強(qiáng)度逐漸增強(qiáng).

聚乙烯磺酸鈉（PVS）在誘導(dǎo)不同濃度的ThT時(shí)形成激基締合物的情況不相同 .在0.100mmol·L－1的ThT各溶液中加入聚乙烯磺酸鈉溶液形成熒光強(qiáng)度較弱的激基締合物，而1.00mmol·L－1的ThT與PVS能形成熒光強(qiáng)度較強(qiáng)的激基締合物 .因此，以1.00 mmol·L－1的ThT與PVS作用形成的激基締合物為例，研究PVS誘導(dǎo)ThT形成激基締合物的影響因素.

2.3 PVS誘導(dǎo)ThT形成激基締合物的影響因素

2.3.1 溶液pH值 ThT分子是通過(guò)靜電吸引作用局部濃縮在PVS大分子周圍形成激基締合物的，所以硫代黃素T分子是否質(zhì)子化應(yīng)該是形成激基締合物的一個(gè)關(guān)鍵條件.為了證明它們之間的靜電吸引作用對(duì)形成激基締合物的重要性，研究了溶液pH值對(duì)ThT分子形成激基締合物的影響.當(dāng)溶液呈酸性時(shí)，ThT分子易質(zhì)子化帶正電荷 .在0.03g·L－1PVS和1.00mmol·L－1ThT的混合溶液中，不同pH值的ThT水溶液的熒光光譜，如圖4所示.

圖3 PVS存在下ThT水溶液的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of ThT aqueous solution at various concentration of PVS

從圖4可以看出：ThT為酸性和中性條件下，其在484nm處出現(xiàn)二聚體峰，并且在長(zhǎng)波方向556 nm處也有一個(gè)無(wú)精細(xì)結(jié)構(gòu)的激基締合物的熒光峰出現(xiàn)；當(dāng)ThT分子在pH值為12.4的堿性條件時(shí)，僅在430nm處出現(xiàn)單體的熒光峰 .這是因?yàn)閴A性條件下，ThT分子沒(méi)有質(zhì)子化，不能通過(guò)靜電吸引作用聚集在PVS大分子周圍，從而不利于硫代黃素T的激發(fā)態(tài)分子和基態(tài)分子相互作用形成激基締合物并產(chǎn)生熒光.當(dāng)1.00mmol·L－1的ThT為酸性和中性時(shí)，其在484nm處有一個(gè)二聚體峰，但在強(qiáng)堿條件下只在430nm處出現(xiàn)單體的熒光峰.

2.3.2 溶劑性質(zhì) 分別配制了1.00mmol·L－1ThT的水、乙醇、丙酮、乙腈、二甲亞砜溶液，再加入0.03g·L－1的聚電解質(zhì)PVS，測(cè)定其熒光光譜，如圖5所示.從圖5可知：在ThT的水溶液中有二聚體和激基締合物的雙重?zé)晒夥宄霈F(xiàn)，而在乙醇、丙酮、乙腈、二甲亞砜溶液中，只有二聚體的熒光峰.這是因?yàn)榫垭娊赓|(zhì)的溶液性質(zhì)與所用溶劑性質(zhì)關(guān)系很大.

在離子化溶劑中，聚電解質(zhì)［15］容易發(fā)生離解，在溶液中形成高分子離子和小分子反離子，表現(xiàn)出電解質(zhì)的性質(zhì)，它不僅和普通高分子的溶液性質(zhì)不同，而且還表現(xiàn)出低分子電解質(zhì)沒(méi)有的特殊行為 .但是若采用非離子化溶劑，則其溶液性質(zhì)與非電解質(zhì)相似.因此，聚電解質(zhì)PVS在水中容易離解成高分子陰離子，能夠靜電吸引帶正電荷的ThT分子，促使ThT在高分子周圍的局部濃度增大，有利于ThT的激發(fā)態(tài)分子和基態(tài)分子相互作用形成激基締合物并產(chǎn)生熒光；而聚電解質(zhì)PVS在乙醇、丙酮、乙腈、二甲亞砜溶液中卻不容易離解，很難與ThT鍵合使其形成激基締合物.

2.3.3 電解質(zhì) 由于ThT激基締合物的形成是由于正負(fù)離子間的靜電作用引起的，因此加入電解質(zhì)肯定會(huì)影響ThT與聚電解質(zhì)分子PVS之間的鍵合.在0.03g·L－1PVS和1.00mmol·L－1ThT的混合溶液中，電解質(zhì)氯化鈉對(duì)ThT二聚體及其激基締合物熒光光譜的影響，如圖6所示.

從圖6可知：逐漸加入氯化鈉會(huì)導(dǎo)致激基締合物熒光強(qiáng)度逐漸降低，而二聚體熒光逐漸增強(qiáng)；當(dāng)NaCl濃度達(dá)到0.100mol·L－1時(shí)，激基締合物熒光峰基本上消失，只能觀察到二聚體的熒光峰；再繼續(xù)增加鹽的濃度，IE／IM變化不大.這是因?yàn)殡娊赓|(zhì)氯化鈉可以“屏蔽”PVS的負(fù)離子和ThT正離子之間的靜電吸引作用［16］，從而在PVS大分子周圍不再出現(xiàn)ThT分子的“局部濃縮”現(xiàn)象，因而不再形成激基締合物.

圖4 不同pH值的ThT水溶液的熒光光譜Fig.4 Fluorescence spectra of ThT aqueous solution at different pH value

圖5 ThT在不同溶劑中的熒光光譜Fig.5 Fluorescence spectra of ThT in different solvents

圖6 NaCl對(duì)ThT水溶液熒光光譜的影響 Fig.6 Effects of NaCl to fluorescence spectra of ThT aqueous solution

2.4 ThT與不同聚陰離子的作用比較

2.4.1 熒光光譜和紫外可見(jiàn)吸收光譜分析 在0.100mmol·L－1的ThT溶液中，加入不同濃度的聚乙烯磺酸鈉（PVS）、聚苯乙烯磺酸鈉（PSS）和聚丙烯酸（PAA）溶液，穩(wěn)定后測(cè)定溶液的熒光光譜，結(jié)果如圖7所示.從圖7可知：當(dāng)ThT水溶液沒(méi)有聚陰離子電解質(zhì)時(shí)，只有單體的熒光峰（λem＝463nm），而當(dāng)加入聚陰離子電解質(zhì)PVS和PSS溶液后，單體熒光強(qiáng)度降低，同時(shí)在長(zhǎng)波長(zhǎng)方向出現(xiàn)一個(gè)新的寬而無(wú)精細(xì)結(jié)構(gòu)的激基締合物的熒光峰.隨著PSS加入量的增加，463nm處的熒光峰逐漸減弱，556nm處的熒光峰逐漸增強(qiáng).當(dāng)PSS濃度達(dá)到一定值時(shí)，556nm處的熒光最強(qiáng).

從圖7（a），（b）可知：增大聚陰離子的濃度，PSS誘導(dǎo)ThT形成的激基締合物的熒光強(qiáng)度超過(guò)了單體峰的強(qiáng)度，單體峰基本消失，而PVS誘導(dǎo)的締合物的熒光強(qiáng)度無(wú)法超過(guò)單體峰的強(qiáng)度，單體峰仍然存在.

從圖7（c）可知：當(dāng)ThT水溶液沒(méi)有PAA時(shí)，只有單體的熒光峰時(shí)，加入少量PAA引起單體熒光強(qiáng)度降低，并沒(méi)有激基締合物的熒光峰出現(xiàn).隨著PAA加入量的增加，463nm處的熒光峰逐漸減弱.當(dāng)PAA濃度達(dá)到一定值時(shí)，繼續(xù)增大PAA濃度，在463nm處單體熒光強(qiáng)度不再變化.實(shí)驗(yàn)表明，PAA不能誘導(dǎo)ThT激基締合物形成.

圖7 不同聚陰離子電解質(zhì)誘導(dǎo)ThT水溶液的熒光光譜Fig.7 Effects of NaCl to fluorescence spectra of ThT aqueous solution

在0.025g·L－1聚陰離子電解質(zhì)和無(wú)聚陰離子電解質(zhì)存在條件下，0.100mmol·L－1ThT水溶液的紫外可見(jiàn)吸收光譜，如圖8所示.由圖8（a）可見(jiàn)：在沒(méi)加入PVS之前，ThT溶液在412，255nm處存在很明顯的吸收峰，而加入PVS之后，255nm處吸收峰強(qiáng)度明顯減弱，412nm吸收峰位有所藍(lán)移，吸光強(qiáng)度變化不大.

前面曾推測(cè)255nm處吸收峰可能歸屬為硫代黃素T二聚體的形成 .由圖8（a）表明：加入PVS后不利于硫代黃素T二聚體的形成，才導(dǎo)致255nm處吸收峰強(qiáng)度明顯減弱，此時(shí)硫代黃素T在溶液中主要以激基締合物的形式和少量的單體形式存在.

和圖8（a）相似，圖8（b）中255nm 處的吸收更小 .這可能是因?yàn)镻SS比PVS對(duì)陽(yáng)離子染料硫代黃素T的作用力更強(qiáng)，更有利于締合物的生成.

圖8 不同聚陰離子電解質(zhì)誘導(dǎo)ThT水溶液的紫外吸收光譜Fig.8 UV absorption spectra of ThT aqueous solution at various concentration of anionic

圖8（c）在加入PAA前后，ThT溶液在412，255 nm處存在很明顯的吸收峰，而且加入前后的強(qiáng)度相差不大，幾乎沒(méi)有變化 .這主要是因?yàn)镻AA的加入沒(méi)有誘導(dǎo)ThT生成激基締合物，溶液中ThT仍以單體和二聚體的形態(tài)存在，與熒光光譜分析的結(jié)果相吻合.

2.4.2 理論計(jì)算法分析 量子化學(xué)可以在分子、電子水平上對(duì)體系進(jìn)行精細(xì)的理論研究，是其他理論研究方法所難以替代的.采用高斯軟件中G09，B3lyp機(jī)組采用的是6－311＋＋g＊＊并進(jìn)行BSSE校正，計(jì)算ThT與PSS，PVS及PAA等3個(gè)陰離子聚合物的鏈接之間的相互作用.選取ThT的最穩(wěn)定構(gòu)象，分別與1個(gè)功能單體分子的鏈接最穩(wěn)定構(gòu)象形成可能的復(fù)合物，優(yōu)化得到各復(fù)合物的穩(wěn)定構(gòu)型，找出最穩(wěn)定構(gòu)型；然后，根據(jù)下式計(jì)算復(fù)合物的結(jié)合能，即

最后，根據(jù)結(jié)合能的大小，判斷復(fù)合物的穩(wěn)定性.由各組分的穩(wěn)定構(gòu)象，計(jì)算得到各復(fù)合物的結(jié)合能，如表1所示.表1中：ΔECP（R）為經(jīng)零點(diǎn)能校正的結(jié)合能.

從表1可知：ThT與PSS，PVS的結(jié)合能較之與PAA的更負(fù)，即PSS，PVS與ThT的作用力比PAA與ThT的作用力強(qiáng).所以，PSS，PVS可誘導(dǎo)ThT形成激基締合物，而PAA則無(wú)法誘導(dǎo)形成締合物.ThT與PSS的結(jié)合能比ThT與PVS的結(jié)合能更負(fù)，故ThT與PSS作用力更強(qiáng) .由此可知，PSS誘導(dǎo)ThT形成激基締合物的能力更強(qiáng).量子化學(xué)理論計(jì)算法所得結(jié)果與光譜法實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致.

表1 各穩(wěn)定構(gòu)象體系的結(jié)合能Tab.1 Energies of various stable conformation systems and their binding energies kJ·mol－1

3 結(jié)束語(yǔ)

研究了陰離子聚電解質(zhì)聚乙烯磺酸鈉（PVS）誘導(dǎo)陽(yáng)離子型染料硫代黃素T（ThT）形成激基締合物，并考察了PVS存在下，ThT在水溶液中所形成激基締合物的各種影響因素.結(jié)果表明：ThT依靠自身濃度的增大是很難形成激基締合物的，但是在PVS存在下卻可以形成激基締合物，而且溶液pH值、溶劑和電解質(zhì)濃度對(duì)ThT激基締合物的形成均有顯著的影響.

［1］OKAMOTO A，ICHIBA T，SAITO I.Pyrene－labeled oligodeoxynucleotide probe for detecting base insertion by excimer fluorescence emission［J］.J Am Chem Soc，2004，126（27）：8364－8365.

［2］PATEL A B，KHUMSUPAN P，NARAUANASWAMI V.Pyrene fluorescence analysis offers new insights into the conformation of the lipoprotein－binding domain of human apolipoprotein E.［J］.Biochemistry，2010，49（8）：1766－1775.

［3］LI Zhe，ZHANG Jing－ping.An efficient theoretical study on host－guest interactions of a fluoride chemosensor with F－ ，Cl－ ，and Br－ ［J］.Chemical Physics，2006，331（1）：159－163.

［4］TONG Hui，WANG Li－xiang，JING Xia－bin，et al.“Turn－On”conjugated polyer fluorescent chemosensor for fluoride ion［J］.Macromolecules，2003，36（8）：2584－2586.

［5］CHIAL L，SRINIVASAN S，JIM M F，et al.Pyrenol［2，1－b］pyrrole and bis（pyreno［2，1－b］pyrrole）as selective chemosensors of fluoride ion：A mechanistic study［J］.J Org Chem，2007，72（9）：3537－3542.

［6］MEI Ming－h(huán)ua，WU Shi－kang.Fluorescence chemical sensor of naphthylmehtyl polyethylenepolyamice［J］.Acta Physico－Chimica Sinica，2000，16（6）：559.

［7］王雯霏，鄭強(qiáng).PS－b－PAA兩親性嵌段聚電解質(zhì)在水溶液中的聚集行為及其流變特性［J］.高分子學(xué)報(bào)，2008（4）：361－365.

［8］彭采宇，仝維鋆，韓寶三，等.不同表面性質(zhì)聚電解質(zhì)多層膜的制備及蛋白質(zhì)吸附和血液相容性能［J］.高等學(xué)?；瘜W(xué)報(bào)，2009，30（11）：2311－2318.

［9］TIAN Wen－de，MA Yu－qiang.Complexation of a linear polyelectrolyte with a charged dendrimer：Polyelectrolyte stiffness effects［J］.Macromolecules，2010，43（3）：1575－1582.

［10］LEE Sang－h(huán)un，TIRUMALA V R，NAGAO M，et al.Dynamics in multicomponent polyelectrolyte solutions［J］.Macromolecules，2009，42（4）：1293－1299.

［11］JOANA F P，ANJA R，ASTRID K，et al.Polyelectrolyte－coated unilamellar nanometer－sized magnetic liposomes［J］.Langmuir，2009，25（12）：6793－6799.

［12］ILANEHELIAN M，RAMARAJ R.Emission of thioflavin T and its eontrol in the presence of DNA［J］.J Photochem Photobiol（A）：Chemistry，2004，162（1）：129－137.

［13］LAKATO?B，KALI?AKOVáB，HUDECOVáD，et al.New effects and applications of thioflavins［J］.Central European Journal of Biology，2010，5（2）：143－150.

［14］BIANCALANA M，KOIDE S.Molecular mechanism of thioflavin－T binding to amyloid fibrils［J］.Biochimica Et Biophysica Acta，2010，1804（7）：1405－1412.

［15］張鵬，錢錦文.聚電解質(zhì)溶液性質(zhì)、層層自組裝膜的構(gòu)筑及滲透汽化性能研究［D］.杭州：浙江大學(xué)，2008.

［16］劉颙颙，葉建平，壽涵森.聚電解質(zhì)對(duì)離子型染料形成激基締合物和能量傳遞的增強(qiáng)作用［J］.化學(xué)學(xué)報(bào)，1987，45（10）：943－948.

Formation of Thioflavin T Excimer Induced by Anionic Polyelectrolyte and Its Influencing Factors

TANG Qi，SUN Xiang－ying，LI Fang
（College of Material Science and Engineering，Huaqiao University，Quanzhou 362021，China）

In this paper，we have studied the formation of thioflavin T（ThT）excimer induced by anionic polyelectrolyte sodium polyethylene sulfonate（PVS）.The influencing factors of the formed Thioflavin T excimer in the presence of PVS were investigated.Furthermore，we have made a study on the interaction of ThT with three kinds of anionic polyelectrolyte（PVS，PSS and PAA）by spectroscopic techniques as well as computational approach of quantum chemistry computational approach of quantum chemistry.Results showed that pH of solution，concentration of solvent and electrolyte affect the formation of ThT excimer significantly.PSS and PVS can promote the formation of excimer，but PAA can not PVS can increase partial concentration of ThT by electrostatic attraction process，markedly promoting the formation of excimer.

thioflavin T；excimer；fluorescence analysis；polyelectrolyte；quantum chemistry

錢筠 英文審校：陳國(guó)華）

1000－5013（2011）06－0646－06

2011－05－11

孫向英（1965－），女，教授，主要從事光化學(xué)和電化學(xué)傳感分析的研究.E－mail：sunxy＠hqu.edu.cn.

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（20955001；20575023）；福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（D0810016）；教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目（2008年度）