關(guān) 婧，李 輝，鄒志遠，何劍為，宋有濤

（遼寧大學生命科學學院，遼寧 沈陽 110036）

氯化鈉促進溶菌酶聚集機制的分子動力學研究

關(guān) 婧，李 輝，鄒志遠，何劍為，宋有濤

（遼寧大學生命科學學院，遼寧 沈陽 110036）

氯化鈉能夠在一定的條件下促進溶菌酶發(fā)生聚集，但其具體的作用機制目前還尚不明確.采用分子動力學模擬的方法研究了雞溶菌酶單體在含500mmol／L NaCl和不含NaCl兩種體系中的結(jié)構(gòu)變化.模擬的結(jié)果表明：NaCl能夠使溶菌酶聚集關(guān)鍵區(qū)域（40～110位殘基）內(nèi)二硫鍵cys76-cys94的結(jié)合強度減弱，同時破壞了該區(qū)域內(nèi)的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，從而導(dǎo)致了蛋白結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性；另一方面，NaCl也促使疏水核心發(fā)生了一定的擴張，使疏水核心內(nèi)氨基酸殘基的結(jié)合變得更加松散，從而促進了溶菌酶分子間的相互作用.

溶菌酶；氯化鈉；淀粉樣聚集；分子動力學模擬

近年來，許多蛋白質(zhì)錯誤折疊導(dǎo)致的疾病，如阿爾茨海默病、瘋牛病、帕金森氏病等，已經(jīng)越來越被關(guān)注，它們的發(fā)生均與蛋白質(zhì)的淀粉樣纖維化沉積有關(guān)，但蛋白質(zhì)淀粉樣纖維化的機制目前尚不清楚［1－2］.已有研究結(jié)果表明，這些蛋白的成纖維傾向除了與其序列和結(jié)構(gòu)有一定的關(guān)系外，更重要的是與蛋白質(zhì)所處的環(huán)境條件密切相關(guān).生物體體液中的各種鹽離子可通過與蛋白質(zhì)的相互作用，使蛋白質(zhì)分子能夠保持正確的結(jié)構(gòu).一旦體液中的離子強度發(fā)生變化，蛋白質(zhì)就可能產(chǎn)生錯誤折疊而生成淀粉樣聚集體［3］.

溶菌酶廣泛存在于鳥類的蛋清和哺乳動物的淚液、唾液、血漿、乳液、胎盤以及體液、組織細胞內(nèi)，以蛋清中含量最豐富（約0.3%）.迄今在世界上發(fā)現(xiàn)的兩種由溶菌酶突變導(dǎo)致的家族遺傳性淀粉樣變性病，患者主要在內(nèi)臟中都產(chǎn)生了大量淀粉樣蛋白的沉淀物，其致死原因是腎損傷或肝出血［4］.溶菌酶蛋白家族具有高度的序列和結(jié)構(gòu)保守性.作為該超家族的成員，雞卵清溶菌酶蛋白同樣具有淀粉樣纖維化傾向［5］.以雞卵清溶菌酶作為模型，近年來美國的Clyston等通過酶交聯(lián)的方法比較分析了酸性條件下NaCl對溶菌酶聚集的影響，結(jié)果表明，該蛋白從3% （500mmol／L）的NaCl梯度開始出現(xiàn)明顯的聚集體并隨著離子強度的增加而增多［6］.另外，李文涓等采用熒光光譜法發(fā)現(xiàn)，在長時間熱脅迫的情況下，NaCl可促進溶菌酶分子的聚集而纖維化［3］.戴國亮等通過動態(tài)光散射法研究不同濃度NaCl對溶菌酶生長晶體的影響時發(fā)現(xiàn)，較高濃度的NaCl可以誘導(dǎo)溶菌酶在溶液中形成較大的聚集體［7］.這暗示著NaCl可能通過某種機制促進溶菌酶的構(gòu)象改變，進而誘導(dǎo)溶菌酶發(fā)生了分子間聚集.但通過常規(guī)實驗的方法對相關(guān)聚集的分子機制是很難探明的.

較傳統(tǒng)實驗方法而言，基于測定的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)和牛頓力學、量子力學的分子動力學模擬（molecular dynamics simulation）能夠利用計算機強大的計算能力模擬再現(xiàn)蛋白質(zhì)納秒數(shù)量級的結(jié)構(gòu)變化過程，并在原子水平上提供有關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)變化的詳細信息，可用于輔助并指導(dǎo)傳統(tǒng)實驗的研究.目前，這種技術(shù)已被逐漸應(yīng)用于蛋白質(zhì)錯誤折疊疾病分子機制的研究中［8－9］.本研究通過模擬分析酸性條件下500mmol／L NaCl對雞卵清溶菌酶單體穩(wěn)定性的影響，從結(jié)構(gòu)動力學的角度深入探討了NaCl促進溶菌酶聚集的分子機制，對于探索蛋白質(zhì)錯誤折疊疾病的機制，理解蛋白質(zhì)在生命過程中的行為具有重要意義.

1 模擬方法和條件

本文采用Gromacs 4.0［10］軟件將雞卵清溶菌酶模型在含500mmol／L NaCl和不含NaCl兩種體系中分別進行10ns分子動力學模擬，使用的力場為GROMDS9643a1，模擬條件為溫度25℃，pH＝1.0.初始結(jié)構(gòu)文件來自于RCSB數(shù)據(jù)庫射線衍射三維坐標文件（PDB編號1GXV）［11］.確定模擬體系的溫度耦合采用“Berendsen-thermostat”法，耦合常數(shù)為0.1ps；壓力耦合采用“Parrinello-Rahman”方法，耦合常數(shù)為0.5ps，參照壓力為1.0×105Pa［12］.采用標準立方盒包裹模型及其他分子，晶體置于盒子中心，選擇溶質(zhì)原子到盒子壁的距離為1nm以保證蛋白質(zhì)有足夠的構(gòu)象變化空間.水溶液環(huán)境下采用SPC模型（含29 174個水分子），加入18個Cl—分子使體系電荷量達到平衡.然后在其中一個體系內(nèi)加入500mmol／L的NaCl.同時，為了減少結(jié)構(gòu)文件轉(zhuǎn)換過程中氫原子被自動加上后，由于粒子與粒子距離過緊而引起不合理的碰撞，將體系以最陡下降法（steep）優(yōu)化1 000步的能量.模擬體系中的遠程范德華力作用距離取1.4nm，經(jīng)典相互作用使用球型截斷半徑“cut-off”方法計算.體系在所有方向上采用周期性邊界條件，時間步長為2fs，模擬結(jié)果用VMD（visual molecular dynamics）［13］軟件進行了系統(tǒng)可視化分析.

2 結(jié)果

2.1 模擬過程中溶菌酶RMSD值的比較分析

RMSD（root mean square deviation，均方根偏差）可用來測量兩個進行比對的蛋白質(zhì)相同位點上的氨基酸殘基碳原子之間的距離，是測定蛋白質(zhì)骨架變化指標衡量模擬過程中蛋白是否達到穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的重要參數(shù)［14］.RMSD值的大小直接反映了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性.如圖1所示，溶菌酶單體在500mmol／L的NaCl模擬體系中整體結(jié)構(gòu)的RMSD值在5ns左右達到平衡（約0.30nm）.與不含NaCl的模擬體系相比，其平均值整體上要高0.05nm左右.這說明了NaCl使得溶菌酶單體的穩(wěn)定性變差，與先前其他研究者在體外生化實驗體系中觀察到的現(xiàn)象是一致的.

2.2 模擬后溶菌酶的結(jié)構(gòu)比對分析

RMSF（root mean square fluctuation，均方根漲落）是蛋白體系最終原子位置同參考位置的比較，它可以通過蛋白中各個氨基酸相對于平均結(jié)構(gòu)的位置偏差來計算蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化的劇烈程度［13］.如圖2（A）所示，500mmol／L的NaCl模擬體系中溶菌酶的氨基酸殘基整體變化幅度均大于不含NaCl的模擬體系，其中變化比較顯著的區(qū)域是第40～110位殘基.這與通過分子生物學實驗得到的結(jié)論，即溶菌酶上觸發(fā)蛋白聚集的關(guān)鍵區(qū)域為57～107位殘基基本上是一致的［15］.因此，我們選取了多肽片段40～110位殘基進行了結(jié)構(gòu)比對（見圖2B）.結(jié)果顯示，在添加NaCl的模擬體系中溶菌酶的α3片段發(fā)生了部分解旋，其螺旋殘基從13個降為8個，而該區(qū)域的環(huán)狀（loop）結(jié)構(gòu)和β片層結(jié)構(gòu)卻分別增加了4.3%和7.1%，表明了片段40～110區(qū)域結(jié)構(gòu)在NaCl存在的情況下具有較高的柔性，另外這些二級結(jié)構(gòu)的變化也是典型的蛋白質(zhì)淀粉樣聚集時的特征.

圖1 RMSD值隨模擬時間的變化

圖2 （A）RMSF值隨模擬時間變化及（B）模擬后結(jié)構(gòu)比對

2.3 關(guān)鍵區(qū)域中二硫鍵的分析

溶菌酶結(jié)構(gòu)中主要存在4個二硫鍵.前期的分子生物學實驗結(jié)果表明，兩個位于關(guān)鍵區(qū)域內(nèi)的二硫鍵cys64-cys80和cys76-cys94在蛋白成纖維過程中起了重要作用，而其他兩個二硫鍵并沒有參與纖維的形成［15］.因此，我們定量分析了溶菌酶二硫鍵cys64-cys80和cys76-cys94在含鹽和不含鹽兩種模擬體系中的變化情況（見圖3）.在分子動力學模擬中，一般認為兩個半胱氨酸之間的距離小于0.4nm為二硫鍵的形成狀態(tài)，而大于0.4nm的為二硫鍵斷裂狀態(tài)［16］.模擬的結(jié)果顯示，二硫鍵cys64-cys80在兩種模擬體系中均未發(fā)生斷裂（見圖3A）.值得注意的是：NaCl使得二硫鍵cys76-cys94從4ns開始表現(xiàn)出明顯的斷裂趨勢，這種趨勢一直延續(xù)到模擬結(jié)束，而不含NaCl的模擬體系中溶菌酶的二硫鍵cys76-cys94并未發(fā)生斷裂（見圖3B）.由于本模擬體系中的二硫鍵沒有被保護，所以并不能確定推導(dǎo)出生化實驗中溶菌酶的二硫鍵cys76-cys94是斷裂的，但是這個結(jié)果暗示著溶液中NaCl可能通過削弱二硫鍵cys76-cys94的強度，使得溶菌酶的構(gòu)象容易發(fā)生轉(zhuǎn)換，從而降低其單體穩(wěn)定性，最后形成分子間聚集.

圖3 二硫鍵距離隨時間的變化

2.4 關(guān)鍵區(qū)域中氫鍵存活時間的分析

氫鍵作為一種非共價結(jié)合作用在維持蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性方面起著重要的作用.近年來許多研究發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的淀粉樣聚集與氫鍵網(wǎng)絡(luò)破壞密切相關(guān)［17］.因此，我們分析了多肽片段40～110位殘基中的氫鍵數(shù)量及存活時間（見圖4）.結(jié)果表明，雖然添加的NaCl模擬體系中溶菌酶氫鍵的數(shù)量略高于不含NaCl體系中的氫鍵數(shù)量（234∶212），但是從整個模擬過程中大于95%的氫鍵存活時間來看，不含NaCl的模擬體系中的氫鍵數(shù)為21個，而NaCl模擬體系中的氫鍵數(shù)僅為14個.由于氫鍵的存活時間相對于單純的數(shù)量對于蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性更有直接意義，這個結(jié)果說明了NaCl的加入可能會導(dǎo)致溶菌酶關(guān)鍵區(qū)域內(nèi)氫鍵網(wǎng)絡(luò)的破壞，從而降低其單體的穩(wěn)定性，趨向于分子間的聚集.

圖4 氫鍵隨模擬時間的變化

2.5 溶菌酶疏水核心的比較分析

蛋白質(zhì)的疏水核心是維持蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的重要組成.此前關(guān)于另一種淀粉樣蛋白胱抑素（cystatin）的分子動力學研究表明，其疏水核心的擴張是形成胱抑素分子間聚集的重要原因［9，18］.因此，本研究分析了NaCl對溶菌酶疏水核心穩(wěn)定性的影響.雞溶菌酶疏水核心結(jié)構(gòu)主要是由15個疏水殘基組成，包括β區(qū)域的Ile-55，Leu-56，Ile-58和α區(qū)域的 Leu-8，Met-12，Trp-28，Ala-31，Ala-32，Phe-34，Phe-38，Ala-95，Ile-98，Ala-107，Trp-108，Ala-110.通過比較疏水核心的溶劑可及表面積（SASA）不僅可以說明疏水核心內(nèi)氨基酸殘基結(jié)合的緊密程度，而且還可確定蛋白質(zhì)整體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性［19］.如圖5（A）所示，溶菌酶疏水核心在NaCl模擬體系中的溶劑可及表面積整體要高于其在不含NaCl模擬體系的數(shù)值，這暗示著NaCl促使溶菌酶的疏水核心氨基酸殘基有向外擴張的趨勢.模擬過程中疏水核心內(nèi)具體每個氨基酸殘基的位移疊加結(jié)果顯示，Trp28，Phe38，Ala107，Trp108，Ala110在NaCl模擬體系中均向外發(fā)生了顯著地擴張（見圖5C），而這些氨基酸殘基在不含NaCl的模擬體系中并未發(fā)生明顯地偏移（見圖5B）.

圖5 疏水核心SASA值隨模擬時間的變化（A）及疏水核心位移疊加圖

3 結(jié)論

綜上所述，我們通過對雞卵清溶菌酶蛋白質(zhì)單體結(jié)構(gòu)模型的分子動力學模擬的研究，提出了NaCl促進溶菌酶的聚集可能的分子機制：一方面NaCl使得溶菌酶聚集關(guān)鍵區(qū)域（40～110位殘基）內(nèi)二硫鍵cys76-cys94的結(jié)合強度減弱，同時破壞了該區(qū)域內(nèi)的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，從而導(dǎo)致了蛋白結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性；另一方面，NaCl促使疏水核心發(fā)生擴張，使得疏水核心內(nèi)氨基酸殘基的結(jié)合變得更加松散，從而促進了溶菌酶分子間的相互作用.這對于深入研究溶菌酶引發(fā)的蛋白質(zhì)錯誤折疊疾病的發(fā)病機制有重要的促進意義，雖然本分子動力學模擬的結(jié)論還有待更多的分子生物學和生物化學實驗的證據(jù)支持.此外，本研究中所采用的研究方法，對有關(guān)這一類由于淀粉樣纖維化沉積引起的蛋白質(zhì)錯誤折疊疾病的研究及治療也提供了一個新的思路.

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Mechanism study of sodium chloride on lysozyme aggregation investigated by molecular dynamics simulation

GUAN Jing，LI Hui，ZOU Zhi-yuan，HE Jian-wei，SONG You-tao
（College of Life Sciences，Liaoning University，Shenyang 110036，China）

Sodium chloride（NaCl）could induce lysozyme aggregation under some conditions，but the detail mechanism has been poorly understood.In this study，performed 10ns molecular dynamic simulations to investigate the structure changes of chicken lysozyme monomer when treated with 500 mmol／L NaCl.The simulation results indicated that NaCl could weaken the disulfide bond cys76-cys94 as well as the hydrogen bonding network in the aggregation critical region，which might lead instability of the lysozyme structure.In addition，results also showed that the hydrophobic core had an apparent expanding tendency when treated with NaCl，which might promote the intermolecular interactions between lysozyme monomers.

lysozyme；sodium chloride；amyloid aggregation；molecular dynamics simulation

Q 71

180·37

A

1000-1832（2011）03-0117-05

2011-04-29

國家自然科學基金資助項目（30970152）；遼寧省教育廳優(yōu)秀人才基金資助項目（2009R26）.

關(guān)婧（1985—），女，碩士研究生；通訊作者：宋有濤（1973—），男，博士，教授，遼寧省動物資源與疫病防治重點實驗室主任，主要從事分子生物學研究

方 林）