楊俊，王文輝，李翼，王齊，孫曉東，朱艷琴

(昆明理工大學(xué)分析測(cè)試研究中心，云南省分析測(cè)試中心，云南昆明，650093)

柱前衍生超高效液相色譜法測(cè)定核桃仁中的氨基酸含量*

楊俊，王文輝，李翼，王齊，孫曉東，朱艷琴

(昆明理工大學(xué)分析測(cè)試研究中心，云南省分析測(cè)試中心，云南昆明，650093)

建立超高效液相色譜法(UPLC)測(cè)定核桃仁中氨基酸的含量。文中采用Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)，AccQ.Tag Ultraa Eluent A及AccQ.Tag Ultraa Eluent B梯度洗脫，流速為0.7 mL/min，波長(zhǎng)248 nm，柱溫55℃。結(jié)果顯示:17種氨基酸在0.003～0.18 mg/mL內(nèi)有良好的線性關(guān)系(r＞0.999 4)，平均回收率(n=6)為98.5%。該方法10 min內(nèi)17種氨基酸能夠完全分離，具有快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好的特點(diǎn)。

超高效液相色譜(UPLC)，氨基酸，核桃仁，含量測(cè)定

核桃(Juglans sigillata Dode)，又名胡桃、羌桃，為胡桃科胡桃屬落葉喬木的果實(shí)。其果仁(核桃仁)營(yíng)養(yǎng)豐富，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪，礦物質(zhì)和維生素。核桃仁中含有18種重要的氨基酸，其中，人體必需氨基酸檢測(cè)出8種，即蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、蛋氨酸［1］。我國(guó)核桃年產(chǎn)量為50萬t，占世界核桃產(chǎn)的30%以上，是世界核桃第一產(chǎn)量大國(guó)，因此可以說，核桃是中國(guó)重要的植物優(yōu)質(zhì)蛋白源。

超高效液相色譜(UPLC)技術(shù)是近年來發(fā)展較快的新型液相色譜檢測(cè)技術(shù)，由于采用了1.7 μm顆粒度的色譜柱填料，因此能夠獲得更高的柱效，并且在更寬的線速度范圍內(nèi)柱效保持恒定，有利于提高流動(dòng)相流速、縮短分析時(shí)間和提高分析通量。相對(duì)于傳統(tǒng)的高效液相色譜法(HPLC)而言，UPLC具有更好的分離效率、峰容量以及靈敏度，為復(fù)雜體系的分離分析提供了良好的技術(shù)平臺(tái)。

目前應(yīng)用于氨基酸分析的主要方法有柱后衍生高效陰離子交換色譜法［2］、柱前衍生反相高效液相色譜法［3］、高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測(cè)法［4］，以上這些方法的分析時(shí)間都需要45～120 min，分析時(shí)間較長(zhǎng)［5］，本文采用柱前衍生UPLC法測(cè)定核桃中的氨基酸含量，對(duì)測(cè)定條件進(jìn)行優(yōu)化，比常規(guī)HPLC法省時(shí)30～40 min，且靈敏度高，準(zhǔn)確性好，是一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法.

1 儀器和試劑

美國(guó)Waters ACQUITY Ultra Performance LC系統(tǒng)，ACQUITY UPLC(r)紫外檢測(cè)器，Waters Empower 2色譜數(shù)據(jù)工作站，17種氨基酸水解標(biāo)準(zhǔn)溶液(美國(guó)Waters公司提供)，AccQ.Tag Ultra Eluent A(醋酸鹽緩沖溶液 pH=5.2，美國(guó) Waters公司提供)，AccQ.Tag Ultraa Eluent B(60%乙腈，美國(guó)Waters公司提供)，Waters AccQ-Fluor試劑盒［包括硼酸緩沖液1、衍生劑粉2A(6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯)、稀釋液2B(乙腈)，美國(guó)Waters公司提供］，乙腈(美國(guó)Fisher公司，色譜純)。

水為超純水，核桃(購(gòu)自昆明金馬正昌果品批發(fā)市場(chǎng))。

2 試驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱:Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm ×100 mm，1.7μm);紫外檢測(cè)波長(zhǎng):248 nm;柱溫55℃;梯度洗脫見表1。理論塔板數(shù)以谷氨酸不低于5 000。

表1 梯度洗脫

2.2 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)使用液的制備

取1支Waters氨基酸標(biāo)準(zhǔn)水解溶液，打開后吸取1 mL，放至一支干凈的25 mL試管中，加9.0 mL超純水，旋渦混勻備用。濃度見表2所示。

2.3 衍生試劑制備

將烘箱預(yù)熱至(55±1)℃，取一瓶衍生劑粉2A，輕輕敲動(dòng)以確保打開前所有粉在瓶底，吸取1 mL稀釋液2B并棄去以沖洗一個(gè)干凈的微量移液吸頭，移1 mL稀釋液2B至2A瓶中，蓋緊瓶蓋，旋渦混勻10 s，55℃加熱5～10 min使衍生劑粉溶解(加熱不得超過10 min)。將溶解后的衍生試劑放入干燥器中，可在室溫保存1 w。

表2 氨基酸使用液濃度

2.4 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)使用液的衍生

將烘箱預(yù)熱至(55±1)℃;用微量進(jìn)樣器吸取10 μL氨基酸標(biāo)準(zhǔn)使用液至一支干凈的樣品管底部，移70 μL硼酸緩沖液至樣品管中，短暫旋渦混勻，移20 μL衍生試劑至樣品管中，立即旋渦混勻數(shù)秒種，室溫放置1 min;用封口膜封口，55℃加熱5 min即可。

2.5 樣品溶液的制備

精密稱取經(jīng)室溫自然晾干并粉碎均勻的核桃仁粉約50 mg，置干燥潔凈的安瓿瓶中，加2 mg苯酚(精制)，加6 mol/L HCl溶液2 mL，充氮，迅速將充好N2的安瓿瓶瓶口置于酒精噴燈上封口，置110℃烘箱中水解24 h，打開安瓿瓶，取1 mL水解液移入蒸發(fā)皿中，蒸干，殘?jiān)盟执蜗礈?，合并洗滌液，濾液移至10 mL容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.6 樣品溶液的衍生

吸取供試品溶液約1 mL，通過0.22 μm微孔濾膜過濾，吸取10 μL濾液按2.4以下同法操作。進(jìn)樣量 1 μL。

3 結(jié)果與討論

3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

將樣品溶液及氨基酸標(biāo)準(zhǔn)使用液依次進(jìn)樣，得色譜圖(圖1)，從圖1中可看出，17種氨基酸完全分離。

圖1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品(A)和核桃仁樣品(B)UPLC色譜圖

3.2 線性關(guān)系考察

精密吸取對(duì)照品溶液 0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 μL按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣進(jìn)樣，測(cè)定，以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積的為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。詳見表3。

表3 氨基酸的檢出限及線性范圍

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取所制備的17種氨基酸溶液，分別在0、6、12、24、36、48 h測(cè)定各氨基酸的峰面積，計(jì)算各氨基酸峰面積的RSD為1.12% ～1.26%。結(jié)果表明，供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一樣品按2.5方法制備6份樣品溶液，分別進(jìn)樣，測(cè)定17種氨基酸峰面積，計(jì)算含量，RSD為1.0% ～1.2%。

3.5 回收率試驗(yàn)

精密稱取已測(cè)知含量的核桃仁樣品25 mg，共6份，分別精密加入17種氨基酸水解標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL，按2.5方法制備供試液并測(cè)定，計(jì)算平均回收率為98.5%，平均RSD=2.1% 。詳見表4。

3.6 樣品含量測(cè)定

采用2.5方法，對(duì)不同的核桃仁樣品進(jìn)行處理，用2.1色譜方法進(jìn)行測(cè)定，各樣品中的氨基酸的含量測(cè)定結(jié)果見表5。同時(shí)用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法(GB/T 5009.124－2003食品中氨基酸的測(cè)定)做對(duì)照實(shí)驗(yàn)，表6為采用UPLC法和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法的結(jié)果比較。從表6可以看出UPLC法和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法得到的氨基酸的含量基本一致，證明本方法可靠性較好。

表4 17種氨基酸的回收率

表5 核桃仁中氨基酸的測(cè)定結(jié)果

表6 采用UPLC法和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法的結(jié)果比較

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用柱前衍生UPLC法對(duì)核桃仁樣品中的17種氨基酸的含量進(jìn)行測(cè)定，10 min內(nèi)17種氨基酸能夠完全分離。比常規(guī)的HPLC法縮短了30～40 min，方法的準(zhǔn)確度和精密度均較高。結(jié)果證明，UPLC法具有快速、高分離度等優(yōu)勢(shì)，將UPLC法替代HPLC法測(cè)定核桃仁中氨基酸含量，準(zhǔn)確、快速，靈敏能提高色譜峰分離度，大大減少分析時(shí)間，提高工作效率，減少溶劑損耗及廢液處置費(fèi)用，適用于核桃仁中氨基酸的快速測(cè)定。

［1］ 郝艷賓，王克建，王淑蘭，莊艷玲.幾種早實(shí)核桃堅(jiān)果中蛋白質(zhì)、脂肪酸組成成分分析［J］.食品科學(xué)，2002，23(10):123－125.

［2］ 墨淑敏;梁立娜;蔡亞岐;牟世芬;溫美娟.高效陰離子交換色譜-電化學(xué)法測(cè)定醬油中的氨基酸［J］.分析試驗(yàn)室，2006(5):36－39.

［3］ 程顯隆;肖新月;鄒秦文;李廣華;田守生.柱前衍生化HPLC法同時(shí)測(cè)定阿膠中4種主要氨基酸的含量［J］.藥物分析雜志，2008(12):1 997 －2 000.

［4］ 于泓;丁永勝;牟世芬.陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測(cè)法分離測(cè)定氨基酸注射液中的氨基酸和葡萄糖［J］.分析化學(xué)，2002(5):398 －402.

［5］ 于泓，牟世芬.氨基酸分析方法的研究進(jìn)展.［J］分析化學(xué)，2005，33(3):398 －404.

Determination of Amino Acids in Walnuts by Ultra Pefformanace Liquid Chromogray(UPLC)with Pre-column Derivation

Yang Jun，Wang Wen-hui，Li Yi，Wang Qi，Sun Xiao-dong，Zhu Yan-qin
(Research Center for Analysis and Measurement，Kuming University of Science and Technology，Kunming 650093，China)(Analytic and Testing Reseach Center of Yunnan，Kunming 650093，China)

To establish an UPLC method in determination the amounts of Amino Acids in Walnuts.A Waters Acquity UPLC BEH C18 column(2.1 mm ×150 mm，1.7μm)was applied，using AccQ.Tag Ultraa eluent A and AccQ.Tag Ultraa eluent B as the mobile phase，with a flow rate of 0.7 mL/min，and the column temperature 55℃.The calibration curve was linear in the range of 0.003～0.18 mg/mL of Amino Acids(r＞0.999 4).The average recovery of Amino Acids was 98.5%.It has the advantage of simple，accuracy，and repeatable in the determination Amino Acids.

ultra performance liquid(UPLC)，amino acids，kernel of walnut，quantitative analysis

學(xué)士，工程師。

2010－03－30，改回日期:2010－12－01