周玉恒，陳海珊，蔡愛華，覃香香，張厚瑞

(廣西植物研究所，廣西桂林，541004)

蒸汽爆破對甘蔗葉酶法制備低聚木糖的影響*

周玉恒，陳海珊，蔡愛華，覃香香，張厚瑞

(廣西植物研究所，廣西桂林，541004)

研究了蒸汽爆破對甘蔗葉酶法制備低聚木糖的影響，分別考察了直接干爆、酸浸預(yù)處理和堿浸預(yù)處理的汽爆效果。得出的結(jié)論如下:蒸汽爆破可以有效破壞物料的表面形狀，增加與酶接觸的表面積，添加酸和堿有利于總糖的溶出，酸性汽爆產(chǎn)生的還原糖比較多，酶解產(chǎn)物中主要是以單糖為主。堿性汽爆的酶解率更高，酶解產(chǎn)物中主要是低聚木糖，占總產(chǎn)物78%～85%，其中木二糖的含量約占40% ～50%。堿性汽爆更有利于低聚木糖的制備。

甘蔗葉，蒸汽爆破，低聚木糖

低聚木糖是一種具有優(yōu)良雙歧桿菌增值功效的低聚糖，在醫(yī)藥、功能性食品、飼料添加劑等方面均有重要的應(yīng)用價值［1－4］。

甘蔗葉是南方重要的農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品，每年產(chǎn)生約1 000萬t，棄于田間，沒有得到有效應(yīng)用。如果能夠利用豐富的蔗葉資源生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品低聚木糖，對于蔗糖產(chǎn)業(yè)的綜合利用，具有十分重大的意義。

本文針對甘蔗葉進行汽爆及酶解，以總糖收率、還原糖爆出率、酶解效率、產(chǎn)物低聚木糖的比率為評價指標，研究蒸汽爆破的條件對低聚木糖制備的影響，為甘蔗葉工業(yè)化利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘蔗葉:采自廣西貴港市田間。

Pulpzyme HC木聚糖酶:諾維信生物技術(shù)有限公司。木糖標準品:本實驗室自制，純度為99.9%。木二糖標準品:日本和光純藥工業(yè)株式會社。木三糖標準品:日本和光純藥工業(yè)株式會社。其它試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器設(shè)備

蒸汽爆破機:QB-200型汽爆工藝試驗臺，河南鶴壁市正道重機集團有限公司;島津高效液相色譜儀:控制器 CBM-20A，在線脫氣器 DGU-20A5，泵 LC-20AT，示差檢測器 RID-10A。手動進樣器7255。T6紫外可見分光光度計:北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 甘蔗葉蒸汽爆破

將甘蔗葉切成3～5 cm段狀，60℃烘12 h以上至恒重，含水量為15%，稱取20 g(含絕干甘蔗葉17 g)，或直接汽爆，或浸入一定濃度的酸或堿溶液中，濾干水分后汽爆。汽爆時將物料置于汽爆腔內(nèi)，關(guān)閉汽爆腔，通入蒸汽，達到預(yù)定壓力后維持一定時間，瞬間點爆，物料腔中收集汽爆物。

1.3.2 甘蔗葉汽爆液的木聚糖酶解

將收集到的汽爆物中和到pH值8，并補足水分至物料的3倍，加入pH8 0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖液(終濃度)，再按100 U/g原干料加入Pulpzyme HC木聚糖酶液，60℃下酶解24 h，檢測酶解后還原糖的增加量，計算酶的水解率。

R1:酶解后還原糖含量，g;R2:酶解前還原糖含量，g;T1:爆出的總糖含量，g;T2:爆出的總還原糖含量，g。

1.4 分析方法

1.4.1 甘蔗葉汽爆液還原糖的測定

將汽爆物用粗紗布過濾，濾液中和到中性，離心，取上清液，采用DNS法測定上清液中還原糖含量。方法為:將待測液體稀釋，取稀釋后的液體0.2 mL，加入0.5 mL的DNS試劑，沸水反應(yīng)5 min后迅速冷卻至室溫，定容到5 mL，于520 nm測定光吸收值，以木糖含量作為標準曲線，木糖含量與OD520nm存在對應(yīng)關(guān)系:

Y為木糖含量，mg/mL;X為520 nm吸光值。

1.4.2 甘蔗葉汽爆液總糖的測定

將汽爆物用粗紗布過濾，濾液中和至pH值7，然后取15 mL，加入5 mL 26%的H2SO4溶液，使之終濃度在6.5%，于100℃水解120 min，水解結(jié)束后中和至中性，用DNS法測定還原糖含量，方法同1.4.1。

總糖=水解后總還原糖×0.9 0.93%苯胺，1.66%鄰苯二甲酸，110℃顯色。

高效液相色譜法:LC sulution色譜工作站、Transgenonic Ca2+柱、85℃柱溫、流動相為超純水，流速 0.3 mL/min，進樣量 20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同汽爆條件對總糖溶出的影響。

將甘蔗葉置于汽爆腔，在不同的壓力下維壓10 min后點爆，外觀如圖1所示，與原料相比，蔗葉直接干爆后，由段狀、片狀變成卷絲狀，表面濕潤，而酸預(yù)處的汽爆物進一步碎成末狀，只有堿預(yù)處理的完全變成了漿糊狀，并且具有一定的流動性，但之中絲狀纖維素束仍然保留。

圖1 甘蔗葉汽爆前后外觀形狀

圖2 不同汽爆條件下總糖的爆出率

汽爆后總糖溶出的趨勢如圖2所示，直接汽爆的甘蔗葉即使壓力上升到2.0 MPa，溶出的總糖未超過物料干重的5%，說明直接干爆雖然外觀已發(fā)生巨大的碎裂，但大部分木聚糖仍然以結(jié)合態(tài)存在于物料中，要使更多的木聚糖游離出來必需增加更多的能耗。相比而言，經(jīng)過酸浸和堿浸處理的甘蔗葉，溶出的總糖卻大為增加，在酸用量1.5%(對原料)和堿的用量為30%(對原料)時，在1.1 MPa的壓力時爆出的總糖分別達到了最高值18.2%和20.93%(對原料)，之后隨著汽爆壓力的增大，總糖成下降趨勢，說明過高的壓力對糖均有一定的破壞作用，尤其是酸爆，壓力越大，總糖下降的幅度越明顯。一旦酸的用量降至0.18%(對原料)，堿用量降至3.5%(對原料)，在所試驗的壓力范圍內(nèi)總糖溶出率一直呈上升趨勢，最高分別達到了17.25%和18.57%(對原料)。因此控制化學(xué)試劑的用量和汽爆的條件均有利于總糖的最大收率。

2.2 不同汽爆條件對還原糖溶出的影響

測定還原糖含量可以判斷出汽爆對木聚糖水解程度的影響。如圖3所示，在所試驗的壓力條件下，直接干爆甘蔗葉由于物理結(jié)構(gòu)破裂不夠充分，溶出的還原糖很少，均未超過2%(對原料)。而酸浸預(yù)處理的甘蔗葉，在試驗的爆破壓力范圍內(nèi)，還原糖的溶出率占總糖溶出率的50% ～80%，遠高于直接干爆和堿浸預(yù)處理，而且用酸量越大，還原糖就越多。在1.5%的酸用量時，還原糖還呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，說明汽爆壓力超過一定值(1.1 MPa)，部分還原糖被破壞生成了非糖物質(zhì)，酸用量降至0.18%時，糖的破壞則要在更高的爆破壓力下(1.7 MPa)才出現(xiàn)。

1.4.3 甘蔗葉汽爆液組分的測定

紙層析法:展層劑為 V(正丁醇)∶V(吡啶)∶V(水)=6∶4∶3，層析 2 次;顯色劑為水飽和正丁醇，含相比而言，堿處理所爆出的還原糖則要少很多，均未超過物料的2%，用堿量越多，還原糖就越少。由此可見，酸的作用主要是通過直接將半纖維素斷裂成可溶性片段溶出，而由于木聚糖的堿溶性，在堿作用下木聚糖則可以以更大分子的形式剝離出來。

圖3 不同汽爆條件下還原糖的溶出率

2.3 不同汽爆條件對酶解率的影響

酶解率是用來評估甘蔗葉汽爆后木聚糖的可酶解性能的，所用的酶為Pulpzyme HC堿性木聚糖酶，該酶水解的主要產(chǎn)物是低聚木糖，占總產(chǎn)物的80%～85%，其中木二糖約占產(chǎn)物的45% ～50%。將汽爆物與該酶在最適條件下反應(yīng)24 h，結(jié)果如圖4所示。直接干爆的物料雖然在外觀上已經(jīng)被撕裂，但游離木聚糖少，酶解率不高。經(jīng)過酸處理汽爆后，酶解率有所提高，并且用酸量越少，酶解率越高，可能酸用量增高會使汽爆液中鹽的濃度、還原性糖濃度、糖分解產(chǎn)生的糠醛濃度增高，從而對酶的活性有抑制作用。而堿浸預(yù)處理的汽爆物酶解率也有類似的趨勢，即3.5%堿用量的酶解率高于30%堿用量，但總的來說，堿爆甘蔗葉比直接干爆和酸爆酶解率更高。

圖4 不同汽爆條件下酶解率

2.4 不同汽爆條件下酶解產(chǎn)物的組成

將酶解24h以后的產(chǎn)物經(jīng)過HPLC檢測，產(chǎn)物中主要是木糖以及木糖的聚合物，未檢測到葡萄糖以及只有微量的葡萄糖存在，說明在試驗的條件下，以半纖維素的溶出為主，并未破壞到物料中的纖維素部分。產(chǎn)物中阿拉伯糖含量亦極少，均未超過總糖的2%，阿拉伯糖是半纖維素結(jié)構(gòu)單元中除木糖以外最主要的成分，存在于側(cè)鏈基團中，在一般的物化處理中均優(yōu)先于木糖溶出，上述結(jié)果表明，與玉米芯等主要的低聚木糖生產(chǎn)原料相比(阿拉伯糖基占半纖維素組分的9% ～10%)，甘蔗葉半纖維素具有更高的同質(zhì)性。

總低聚木糖(木二～木七糖)產(chǎn)生趨勢如圖5所示。酸浸汽爆的酶解產(chǎn)物中含有較多的木糖，而且低聚木糖的含量有隨著汽爆壓力的升高而不斷下降，當酸用量為1.5%和0.18%時，在獲得最大的總糖收率時酶解產(chǎn)物中低聚木糖的含量分別僅占28.4%和47%，因此加酸汽爆雖然能在較溫和汽爆條件溶出最大量的總糖，但副產(chǎn)物過多對低聚木糖的生產(chǎn)是不利的。而直接干爆和堿浸汽爆由于溶出的還原糖很少，汽爆物酶解產(chǎn)物主要是由低聚木糖組成。當堿用量為30%和3.5%時，在爆出總糖最高的條件下低聚木糖分別占產(chǎn)物的85%和78%。不同預(yù)處理總糖溶出率最大時酶解產(chǎn)物紙色譜如圖6。因此堿爆更有利于得到高品質(zhì)的低聚木糖產(chǎn)品(如圖7所示HPLC圖)。

圖5 不同汽爆條件下總低聚木糖的含量

圖6 最高總糖收率時酶解產(chǎn)物紙色譜圖

丁長河等人比較了高溫蒸煮與微波處理對玉米芯制備低聚木糖的影響，發(fā)現(xiàn)高溫蒸煮酸浸的玉米芯雖然可以獲得很高的木聚糖提取率，但酶解產(chǎn)物主要是單糖;而微波處理堿浸的玉米芯后酶解，產(chǎn)物主要是木二糖，制備低聚木糖更為理想［5］。雷光鴻［6］，崔素芬［7］等利用蒸汽爆破結(jié)合酸降解處理提取甘蔗葉木糖。呂曉晶［8］等用微波考察酸法、堿法、雙氧水法處理過的小麥麩皮證實堿法更有利于制備低聚木糖。羅鵬［9］等研究催化蒸汽爆破強度對麥草酶水解影響也指出，酸催化的主要產(chǎn)物是單糖。本研究與上述同類研究證明:酸主要以O(shè)-糖苷鍵斷裂的方式使木聚糖發(fā)生水解，生成單糖或低聚糖(酸量不足時，木聚糖發(fā)生不完全水解的產(chǎn)物);堿主要使木聚糖脫乙?；扇苡谒挠坞x木聚糖，生成單糖的堿水解(苷鍵直接開裂)，或還原性端基逐個脫落的剝皮反應(yīng)不是在本實驗堿爆條件的主要反應(yīng)。

圖7 堿爆酶解產(chǎn)物HPLC圖

3 結(jié)論

(1)蒸汽爆破的目的是將物料中的木聚糖盡可能與其它的物質(zhì)分開，部分水解游離出來，使之能充分地與木聚糖酶接觸，提高酶解的效率與產(chǎn)物收率，同時也要盡可能控制汽爆的條件，避免木聚糖過度水解成副產(chǎn)物木糖甚至分解成糠醛等物質(zhì)，因此汽爆總糖收率、汽爆物的酶解效率、酶解產(chǎn)物中有效成分的含量是考察汽爆效果的主要指標。試驗結(jié)果證明，蒸汽爆破可以有效改變物料表面物理形狀，從而利于酶的接觸。但添加酸和堿的甘蔗葉可以在較溫和的汽爆條件下獲得較大的總糖收率。

(2)酸性汽爆下木聚糖主要通過糖苷鍵的斷裂，使木聚糖形成可溶性片段溶出，在獲得木聚糖最大收率時，已有較多木聚糖水解成木糖、木二糖等還原糖形式，部分抑制了木聚糖酶的活性，致使酶解產(chǎn)物中有效成分偏少，副產(chǎn)物過多。堿性汽爆主要是在堿的作用下木聚糖側(cè)鏈乙酰基斷裂，木聚糖以大分子的形式游離出來，因此產(chǎn)生游離單糖較少，酶解率較高，產(chǎn)物中主要是以低聚木糖為主。

(3)傳統(tǒng)酶法制備低聚木糖一般先用堿將木聚糖提取出來然后酶法水解，需要消耗原料干重60%～120%的堿和較長的提取時間(12～24 h)［10－11］。本研究在 3.5% 的用堿量時(對物料)，在2.0 MPa壓力下，10 min維壓可以爆出18.57%的總糖，酶解率達65.48%，酶解產(chǎn)物中總低聚木糖占78%，其中木二糖占50%。低堿汽爆是更環(huán)保有效的生產(chǎn)低聚木糖的方式。

(4)甘蔗葉質(zhì)地相對疏松，所用汽爆條件相應(yīng)較低，與現(xiàn)在低聚木糖的主要生產(chǎn)原料玉米芯相比，更容易實現(xiàn)環(huán)境友好生產(chǎn)，而且甘蔗葉木聚糖含量達22%～25%，木聚糖中阿拉伯糖基含量遠低于玉米芯，易于獲得更高品質(zhì)的產(chǎn)品，作為低聚木糖生產(chǎn)原料并不遜色于玉米芯。

［1］ 蔣正宇，周巖民，許毅，等.低聚木糖、益生菌及抗生素對肉雞腸道菌群和生產(chǎn)性能的影響［J］.家畜生態(tài)學(xué)報，2005，26(2):11 －15.

［2］ 李平蘭，江志杰，馬長.長壽老人源雙歧桿菌優(yōu)良菌株的篩選［J］.微生物學(xué)通報，2005，32(3):7 －12.

［3］ Donkor O N，Henriksson A，Vasiljevic T，et al.Effect of acidification on the activity of probiotics in yonghurt during cold storage［J］.International Dairy Jorunal，2006，16(10):1 181－1 189.

［4］ Fandi K G，Ghazali H M，Yazid A M，etal.Purification and N2terminal amino acid sequence of fructose-6-phosphate phosphoketolase from Bifidobacterium longum BB536［J］.Lett App ，Microbiol，2001，32:235 －239.

［5］ 丁長河，宋娜，李里特.高溫蒸煮法與微波法處理玉米芯制備低聚木糖比較［J］.食品研究與開發(fā)，2006，127(9):68－71.

［6］ 雷光鴻，崔素芬，柳嘉，等.甘蔗葉蒸汽爆破法提取低聚木糖的工藝研究［J］.食品科技，2009，34(8):146－150.

［7］ 崔素芬，李堅斌，杭方學(xué)，等.蒸汽爆碎處理甘蔗葉提取木糖的研究［J］.食品工業(yè)科技，2010，31(1):21 －219.

［8］ 呂曉晶，韓玉潔.微波處理對小麥麩皮酶法制取低聚木糖的影響［J］.食品研究與開發(fā)，2010，31(4):50 －52.

［9］ 羅鵬，劉忠，王高升.酸催化的蒸汽爆破預(yù)處理強度對麥草酶水解影響的研究［J］.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2006，6(4):105－109.

［10］ 丁勝華，歐士益，趙健，等.利用蔗渣制備低聚木糖的工藝［J］.食品研究與開發(fā)，2010，31(4):23 －27.

［11］ Wang Yanhui，Zhang Jinchang.A novel hybrid process，enhanced by ultrasonication，for xylan extraction from corncobs and hydrolysis of xylan to xylose by xylanase［J］.Journal of Food Engineering，2006，77:140 －145.

The Influence of Steam Explosion on Enzymatic Preparation of Xylooligosaccharides from Sugarcane Leaves

Zhou Yu-heng，Chen Hai-shan，Cai Ai-hua，Tan Xiang-xiang，Zhang Hou-rui
(Guangxi Institute of Botany，The Chinese Academy of Sciences，Guilin 541004，China)

In this paper，steam explosion in various conditions was studied in order to reveal its impact on preparation of xylooligosaccharides from sugarcane leaves by enzymatic hydrolysis.The results demonstrated that steam explosion could effectively break down the surface of materials and make it easier for enzymetic hydrolysis.The addition of acid or alkli facilitated xylan＇s release.On one hand，acidic steam-explosion contributed to sugar reduction and was responsible for the poor proportion of xylooligosaccharides in the end-product.On the other hand，alkalic steam-explosion made xylan extraction easy in the form of large molecule and generating less reducing sugar.Higher rate of enzymatic hydrolysis was also attributed to alkalic steam-explosion.Finally，when the steam explosive substance was hydrolyzed by xylanase，it produced 78% ～85%xylooligosaccharides including 40% ～50%xylobinose.Steam－explosion assisted by alkali was a good method for manufacturing of xylooligosaccharides.

sugarcane leaves，steam explosion，xylooligosaccharides

碩士，助理研究員(E-mail:zhouyuheng6379@sohu.com)。

*廣西自然科學(xué)基金(桂科自0832221)

2010－08－11，改回日期:2010－09－21