金紅星，史建波，成文玉，莒曉艷

(河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，天津，300130)

以蔗糖為原料明串珠菌發(fā)酵生產(chǎn)甘露醇

金紅星，史建波，成文玉，莒曉艷

(河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，天津，300130)

腸 膜明串珠菌CGMCC 1.10327為發(fā)酵菌株，質(zhì)量濃度為2%的蔗糖為底物，采用分批發(fā)酵，研究甘露醇的生成。為了優(yōu)化甘露醇的生成，分別考察了添加5 g/L的葡萄糖、3種鹽(K2HPO4、乙酸鈉、檸檬酸銨)、不同的初始pH和加入0.2%的CaCO3對(duì)產(chǎn)甘露醇的影響。結(jié)果表明，葡萄糖的加入有助于提高甘露醇的產(chǎn)量。3種鹽(K2HPO4、乙酸鈉、檸檬酸銨)對(duì)甘露醇的生成有明顯的影響，當(dāng)分別為2 g/L、5 g/L和2 g/L時(shí)，甘露醇的產(chǎn)量最高。最佳的初始pH=6。向培養(yǎng)基中加入0.2%的CaCO3，甘露醇的產(chǎn)量明顯的降低。

蔗 糖，腸膜明串珠菌，分批發(fā)酵，甘露醇

甘露醇是一種多元醇，白色結(jié)晶性粉末，甜度為蔗糖的一半。在醫(yī)藥、化工、食品等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用［1－2］。目前生產(chǎn)甘露醇的方法主要是催化加氫，以鎳(Ni)為催化劑在高溫(120～160℃)高壓(70～140atm)下加氫還原葡萄糖/果糖(1∶1)的混合物，其中葡萄糖全部轉(zhuǎn)化為甘露醇的異構(gòu)體山梨醇，果糖50%轉(zhuǎn)化為甘露醇，而另50%轉(zhuǎn)化為山梨醇，山梨醇和甘露醇之比為3∶1［3］。催化加氫法有很多缺點(diǎn):需要高純度原料，包括氫氣，昂貴的金屬催化劑等;需要較高的溫度和壓力;需要昂貴的色譜純化方法從產(chǎn)品中除去鎳;甘露醇的產(chǎn)率低;山梨醇和甘露醇的分離純化比較困難［2］。

一些微生物可利用果糖或葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)生甘露醇［4－8］。與化學(xué)合成法相比微生物發(fā)酵法有很多優(yōu)點(diǎn)，比如沒(méi)有副產(chǎn)物山梨醇的產(chǎn)生、溫和的反應(yīng)條件、不需要高純度原料、分離純化設(shè)備要求不高等［2］。近些年人們關(guān)注于異型發(fā)酵的乳桿菌、明串珠菌，能夠在胞內(nèi)產(chǎn)生一種甘露醇脫氫酶，將果糖高效轉(zhuǎn)化為甘露醇，而不產(chǎn)生山梨醇［9］。但果糖作為底物相對(duì)比較昂貴，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。為了降低生產(chǎn)成本，必需選擇廉價(jià)的底物［10］。蔗糖相對(duì)便宜，并且大量存在于自然界中，能夠被明串珠菌利用產(chǎn)生甘露醇。本研究以蔗糖為底物，優(yōu)化明串珠菌發(fā)酵生成甘露醇。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料1.1.1 菌株

腸膜明串珠菌CGMCC 1.10327，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基:蔗糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，MnSO4·H2O 0.039 g/L，K2HPO42 g/L，檸檬酸銨2 g/L，乙酸鈉5 g/L，蒸餾水 1 000 mL，pH 6.2，121℃滅菌 15 min。

1.1.3 主要儀器

722N型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 培養(yǎng)方法

發(fā)酵培養(yǎng):按接種量1% 接種于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，于30℃，120 r/min振蕩培養(yǎng)，不通空氣。發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值調(diào)至6.0。

1.3 分析方法

菌體的生物量:將0.5 mL發(fā)酵液稀釋10倍，測(cè)定稀釋液在600 nm的濁度(OD600)。取5 mL發(fā)酵液，離心收集菌體并用蒸餾水洗滌2次后置于凍干機(jī)中冷凍干燥，干燥完全后在分析天平上測(cè)量細(xì)胞干重。建立濁度與細(xì)胞干重的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)將濁度轉(zhuǎn)化為細(xì)胞干重，作為菌體的生物量。

甘露醇的量:將發(fā)酵液離心沉淀，取上清液，采用改進(jìn)的高碘酸鈉氧化法檢測(cè)甘露醇的量［11］。每一樣品進(jìn)行3次平行檢測(cè)，取平均值。

2 結(jié)果和討論

2.1 添加葡萄糖對(duì)產(chǎn)甘露醇的影響

將明串珠菌CGMCC 1.10327接種于含葡萄糖(葡萄糖5 g/L，其他成分與MRS相同)和不含葡萄糖(MRS)的2種發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行分批發(fā)酵，研究葡萄糖對(duì)產(chǎn)甘露醇的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1中可以看出，葡萄糖的加入對(duì)菌體的生長(zhǎng)速率和生長(zhǎng)總量幾乎沒(méi)有影響。明串珠菌在蔗糖中的生長(zhǎng)速率大于在葡萄糖的生長(zhǎng)速率［12］。由此可見(jiàn)，葡萄糖和蔗糖同時(shí)存在時(shí)，對(duì)菌體的生長(zhǎng)并沒(méi)有產(chǎn)生疊加效應(yīng)。

圖1 葡萄糖對(duì)產(chǎn)甘露醇的影響

葡萄糖的加入有助于提高甘露醇的產(chǎn)量(見(jiàn)圖1)。在含有葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中，甘露醇的最高產(chǎn)量為7.05 g/L，在不含葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中，甘露醇的最高產(chǎn)量為5.6 g/L，葡萄糖的加入明顯的提高了甘露醇的產(chǎn)量。在發(fā)酵中，蔗糖代謝產(chǎn)生的果糖部分轉(zhuǎn)化為甘露醇，部分進(jìn)行能量代謝。葡萄糖的加入有利于蔗糖代謝產(chǎn)生的果糖更多的轉(zhuǎn)化為甘露醇，從而提高了甘露醇的轉(zhuǎn)化率。

2.2 三種鹽對(duì)產(chǎn)甘露醇的影響

在培養(yǎng)基(酵母浸粉2 g/L，去掉蛋白胨，其它成分與MRS相同)中考察了3種鹽(K2HPO4、乙酸鈉、檸檬酸銨)對(duì)產(chǎn)甘露醇的影響。設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)，每一種鹽選取5個(gè)不同的濃度，發(fā)酵18 h檢測(cè)甘露醇和菌體的量，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可以看到，K2HPO4、乙酸鈉和檸檬酸銨的加入對(duì)明串珠菌發(fā)酵產(chǎn)甘露醇有明顯的影響，當(dāng)K2HPO4、乙酸鈉和檸檬酸銨的量分別為2 g/L、5.0 g/L和2 g/L，甘露醇的產(chǎn)量最高。

明串珠菌以蔗糖為底物進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，在胞內(nèi)生成一種蔗糖磷酸酶，將蔗糖轉(zhuǎn)化為1-磷酸-D-葡萄糖(Glc-1-P)和D-果糖［13］，在這個(gè)反應(yīng)中需要磷酸根離子作為底物，當(dāng)培養(yǎng)基中不存在磷酸根離子時(shí)，蔗糖磷酸酶的催化反應(yīng)受到抑制，因此甘露醇的轉(zhuǎn)化量減少。Yun［6］研究了在明串珠菌Y-002發(fā)酵果糖產(chǎn)生甘露醇的過(guò)程中不同的磷酸根離子濃度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生的影響，發(fā)現(xiàn)隨著磷酸根離子濃度的增加，甘露醇的產(chǎn)量有輕微的增加。明串珠菌在發(fā)酵蔗糖時(shí)生成乳酸和乙酸，當(dāng)在培養(yǎng)基中加入適量的乙酸鈉，乙酸鈉在作為緩沖劑的同時(shí)，可能對(duì)乳酸和乙酸的代謝產(chǎn)生反饋抑制作用，進(jìn)而有利于甘露醇的生成。在細(xì)胞中檸檬酸分解成乙酸和草酰乙酸，草酰乙酸脫羧變?yōu)楸幔徇M(jìn)一步代謝形成乳酸。檸檬酸代謝產(chǎn)生的能量(NAD(P)H)有利于果糖轉(zhuǎn)化為甘露醇［14］。

表1 三種鹽(K2HPO4、乙酸鈉、檸檬酸銨)對(duì)產(chǎn)甘露醇的影響

2.3 初始pH值對(duì)產(chǎn)甘露醇的影響

在培養(yǎng)基(酵母浸粉2 g/L，去掉蛋白胨，其他成分與MRS相同)中考察初始pH值對(duì)明串珠菌發(fā)酵產(chǎn)甘露醇的影響，將培養(yǎng)基的初始pH值分別調(diào)至5、5.5、6、6.5、7，結(jié)果見(jiàn)圖 2。

圖2 不同初始pH值發(fā)酵18 h甘露醇和菌體的量

從圖2中可以清晰看出，當(dāng)初始pH值為7時(shí)，菌體的生長(zhǎng)量最大(在本試驗(yàn)的pH范圍內(nèi))，隨著初始pH的降低，菌體的生長(zhǎng)量隨之減少。當(dāng)初始pH值為6時(shí)，甘露醇的產(chǎn)量最大，達(dá)到7.45 g/L。結(jié)果表明，初始pH值過(guò)低時(shí)，抑制了菌體的生長(zhǎng)代謝，從而對(duì)底物的利用率降低，因此甘露醇產(chǎn)量明顯減少。當(dāng)初始pH值較高時(shí)，菌體的生長(zhǎng)代謝相對(duì)旺盛，更多的底物進(jìn)入戊糖磷酸代謝途徑轉(zhuǎn)化為乳酸和乙酸，其中由蔗糖代謝產(chǎn)生的果糖可能更多的進(jìn)入能量代謝途徑，而沒(méi)有轉(zhuǎn)化為甘露醇，致使甘露醇的產(chǎn)量有所減少。因此我們選擇初始pH值為6作為發(fā)酵蔗糖產(chǎn)甘露醇的最優(yōu)初始值。

2.4 添加CaCO3對(duì)產(chǎn)甘露醇的影響

在培養(yǎng)基(酵母浸粉2 g/L，去掉蛋白胨，其他成分與MRS相同)中加入質(zhì)量濃度為0.2%的CaCO3，考察CaCO3對(duì)產(chǎn)甘露醇的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3中可見(jiàn)，CaCO3的加入有助于菌體的生長(zhǎng)，菌體的生長(zhǎng)速率和生長(zhǎng)量相對(duì)于不加入CaCO3的發(fā)酵液有明顯提高。在含有CaCO3的發(fā)酵液中甘露醇的最大產(chǎn)量為4.12 g/L，而在不含有CaCO3的發(fā)酵液中甘露醇的最大產(chǎn)量為7.1 g/L。CaCO3的存在使甘露醇的產(chǎn)量明顯的減少。

圖3 添加CaCO3對(duì)產(chǎn)甘露醇的影響

明串珠菌在發(fā)酵蔗糖時(shí)，代謝產(chǎn)生乳酸和乙酸，發(fā)酵液的pH值會(huì)大幅度下降，最終達(dá)到4左右［6］。在培養(yǎng)基中加入CaCO3，中和乳酸和乙酸，調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值，促使更多的果糖進(jìn)入戊糖磷酸途徑代謝產(chǎn)生能量，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)，而降低甘露醇的轉(zhuǎn)化率，最終影響甘露醇的產(chǎn)量。因此，在相同的發(fā)酵條件下，調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值并不能促進(jìn)甘露醇的生成，反而降低甘露醇的產(chǎn)量。

3 結(jié)論

(1)以質(zhì)量濃度為2%的蔗糖為底物進(jìn)行明串珠菌發(fā)酵時(shí)，5 g/L葡萄糖的加入對(duì)菌體的生長(zhǎng)不產(chǎn)生影響，但明顯的提高了甘露醇的產(chǎn)量。

(2)3種鹽(K2HPO4、乙酸鈉、檸檬酸銨)的單因素試驗(yàn)表明，3種鹽的量分別為2、5.0和2 g/L時(shí)，甘露醇的產(chǎn)量最高。

(3)從不同初始pH值試驗(yàn)可以看出，初始pH值6時(shí)，甘露醇的產(chǎn)量最大。

(4)CaCO3添加試驗(yàn)可以看出，調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH不利于甘露醇的轉(zhuǎn)化，降低了甘露醇的產(chǎn)量。

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Production of Mannitol from Sucrose by Leuconostoc mesenteroides

Jin Hong-xing，Shi Jian-bo，Cheng Wen-yu，Ju Xia-yan
(Institute of Chemical Technology，Hebei University of Technology，Tianjing 300130，China)

The production of mannitol by Leuconostoc mesenteroides CGMCC 1.10327 using sucrose(2%，m/v)as the carbon source was investigated in batch culture fermentation.To optimize the production of mannitol，the effects of glucose(5 g/L)，three salt nutrients(K2HPO4，NaAC，and ammonium citrate)，various initial culture pHs，and 0.2%CaCO3on the production of mannitol were investigated，respectively.The results showed that glucose contributed to improve the yield of mannitol.Three salt nutrients(K2HPO4，NaAC，and ammonium citrate)had significant effects on the production of mannitol，and the highest yield of mannitol was obtained when three salt nutrients were 2 g/L，5.0 g/L，and 2 g/L，respectively.The highest yield of mannitol was obtained at initial pH 6.0.Moreover，the yield of mannitol was significantly decreased by adding CaCO3.

sucrose，Leuconostoc mesenteroides，in batch culture fermentation，mannitol

博士，副教授。

2010－09－05，改回日期:2010－10－30