劉歡，賀連斌，魏靜，馬中蘇

(吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng) 春，130025)

纖維素酶和半纖維素酶改性胡蘿卜纖維的研究*

劉歡，賀連斌，魏靜，馬中蘇

(吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng) 春，130025)

以胡蘿卜渣中的纖維為原材料，研究纖維素酶和半纖維酶對(duì)胡蘿卜纖維的長(zhǎng)度、寬度以及還原糖濃度和聚合度的影響，并對(duì)在胡蘿卜纖維改性過(guò)程中纖維素酶和半纖維酶協(xié)同作用的機(jī)理進(jìn)行探討。結(jié)果表明，纖維素酶和半纖維素酶復(fù)合使用比單一酶對(duì)胡蘿卜纖維改性效果明顯。在兩者的協(xié)同作用下，可以改善纖維表面的細(xì)纖維化，提高纖維的酶解產(chǎn)率，降低纖維的聚合度。

纖維素酶，半纖維素酶，胡蘿卜纖維

植物纖維是地球上最大的可再生資源和最豐富的多糖類物質(zhì)，它主要由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等組成。傳統(tǒng)的酶改性僅使用纖維素酶，但經(jīng)過(guò)處理的植物纖維仍然含有半纖維素和少量的木質(zhì)素，半纖維素和木質(zhì)素對(duì)纖維素酶具有同樣的吸附作用，使得纖維素酶的用量增加。通過(guò)其他酶與纖維素酶配合，可以增加纖維素酶的利用率，以及改善纖維的性能［1－2］。因此，研究纖維素酶和半纖維素酶之間、復(fù)合纖維素酶各組分之間的協(xié)同作用，以及各個(gè)純化的酶組分在酶改性中所起作用成為研究的熱點(diǎn)。在食品工業(yè)中，纖維素酶、半纖維素酶和果漿酶一起使用有利于水果和蔬菜的浸軟及果汁的澄清［3－4］。

近年來(lái)，果蔬飲料消費(fèi)量逐年增加，而這些產(chǎn)品在加工過(guò)程中產(chǎn)生大量果蔬渣。這些果蔬渣除很少一部分經(jīng)粗加工用作動(dòng)物飼料、發(fā)酵檸檬酸、提取果膠外，大部分作為廢棄物被丟棄，造成農(nóng)副產(chǎn)品的巨大浪費(fèi)。據(jù)估計(jì)，我國(guó)每年產(chǎn)生的鮮蘋果渣約100萬(wàn)t［5］。在胡蘿卜加工過(guò)程中，得到的胡蘿卜渣約占原料的30% ～50%，而其含有的胡蘿卜纖維則占56%［6］。

本課題采用纖維素酶和半纖維素酶對(duì)胡蘿卜纖維進(jìn)行改性，通過(guò)對(duì)胡蘿卜纖維的數(shù)量平均長(zhǎng)度、小于0.2 mm的細(xì)小纖維含量、平均寬度以及還原糖濃度和聚合度的研究，分析在酶改性過(guò)程中纖維酶和半纖維素酶對(duì)纖維素分子鏈斷裂的變化情況，并對(duì)兩者協(xié)同作用的機(jī)理進(jìn)行探討。研究結(jié)果為胡蘿卜纖維在膳食纖維食品、蔬菜紙和可食性包裝材料的應(yīng)用以及纖維素酶和半纖維素酶在纖維改性過(guò)程中協(xié)同作用的研究提供數(shù)據(jù)參考。同時(shí)，用胡蘿卜渣作原料可減少環(huán)境污染，對(duì)提高胡蘿卜附加值具有研究意義。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

酶制劑種類及其特性見表1。

表1 酶制劑種類及其特性

胡蘿卜渣、檸檬酸、檸檬酸鈉、NaOH、HCl、3，5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、苯酚、NaHSO3、I2、KI、Na2S2O3、Na2SO4、Na2CO3、CuSO4·5H2O、氨水、乙二胺、甲基橙、淀粉、硫氰酸銨。

HJ-4型多頭磁力攪拌器，江蘇金壇市恒豐儀器廠;GB-303型電子天平，梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司;KFG-01型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，湖北省黃石市醫(yī)療儀器廠;TU-1810紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;PHS-25數(shù)字酸度計(jì)，杭州東星儀器設(shè)備廠;堿式滴定管，沈陽(yáng)市衛(wèi)工玻璃計(jì)器廠;0.57 mm型烏式黏度計(jì)，沈陽(yáng)市衛(wèi)工玻璃計(jì)器廠;JZ-K型造紙纖維測(cè)量?jī)x，南通三思機(jī)電科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 胡蘿卜纖維的制備

胡蘿卜渣和水按質(zhì)量比1∶2混合，用10%HCl調(diào)節(jié)料液至pH值1.5，85℃下浸提2h，過(guò)濾，水洗濾渣至中性。濾渣按料液比1∶10(g∶mL)加入10%NaOH溶液，25℃浸提20 h，用濾布過(guò)濾，水洗濾渣至中性，加入等量NaClO，再用50%醋酸調(diào)節(jié)至pH 6，50℃加熱1h，冷卻至室溫，過(guò)濾。

1.2.2 胡蘿卜纖維的改性

酶改性條件:pH值4.8，溫度50℃，時(shí)間1 h;胡蘿卜纖維用量為20 g/L;纖維素酶用量分別為30、60、90、120和150 IU/g;半纖維素酶用量分別為0、12、24、36、48 和 60 IU/g。

1.2.3 纖維素的長(zhǎng)度和寬度

采用JZ-K造紙纖維測(cè)量?jī)x進(jìn)行纖維長(zhǎng)度和寬度的測(cè)定。

1.2.4 纖維素的聚合度

按照GB/T1548-1989《紙漿黏度的測(cè)定—毛細(xì)管法》來(lái)測(cè)定紙漿黏度。利用黏度與聚合度關(guān)系，計(jì)算出纖維素分子的聚合度(DP)。

1.2.5 纖維素的還原糖濃度

DNS 配制:3，5-二硝基水楊酸 7.5 g、NaOH 14.0 g、酒石酸鉀鈉216 g、苯酚5.5 mL和 NaHSO36.0 g分別溶解于1 000 mL蒸餾水中，棕色瓶冷藏保存。

取1支刻度試管放入0.05 g胡蘿卜纖維試樣，分別加入0.5 mL酶液和1 mL的0.05 mol/L檸檬酸緩沖液(pH 4.8)。50℃水浴中保溫1h后取出，加入3 mL DNS溶液，充分搖勻后沸水浴顯色5 min，取出冷卻后用蒸餾水定容到25 mL，充分混勻，靜置20 min。在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，由葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出還原糖濃度(以葡萄糖表示)。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素酶和半纖維素酶用量對(duì)胡蘿卜纖維長(zhǎng)度的影響

試驗(yàn)結(jié)果見表2。從表2可以看出，在纖維素酶用量一定，半纖維素酶用量為0～24 IU/g時(shí)，隨半纖維素酶用量的增加，數(shù)量平均長(zhǎng)度上升，細(xì)小纖維含量下降。這因?yàn)榘肜w維素酶優(yōu)先吸附到半纖維素和細(xì)小纖維的表面，半纖維素和細(xì)小纖維被酶解溶出。同時(shí)，半纖維素酶破壞了半纖維素對(duì)纖維素酶吸附作用，纖維素酶的酶解效率提高。細(xì)小纖維部分被酶解溶出，導(dǎo)致細(xì)小纖維含量的下降，故纖維的數(shù)量平均長(zhǎng)度相應(yīng)上升［7］。半纖維素酶用量為24～60 IU/g時(shí)，隨半纖維素酶用量的增加，細(xì)小纖維含量上升，纖維數(shù)量平均長(zhǎng)度下降。這因?yàn)榘肜w維素和細(xì)小纖維已被酶解溶出，纖維素酶酶解作用增強(qiáng)，長(zhǎng)纖維被分裂成尺寸較小的細(xì)小纖維，從而使纖維的數(shù)量平均長(zhǎng)度相應(yīng)下降。

表2 纖維素酶和半纖維素酶用量對(duì)胡蘿卜纖維長(zhǎng)度的影響

在半纖維素酶用量一定，纖維素酶用量為30～60 IU/g時(shí)，隨纖維素酶用量的增加，纖維的數(shù)量平均長(zhǎng)度有所上升，但上升幅度不大。這因?yàn)殡m然酶在細(xì)小組分上的酶解作用比纖維組分占優(yōu)勢(shì)，但細(xì)小纖維也具有一定的結(jié)晶度，所以在纖維素酶酶解過(guò)程中仍有一部分存留在纖維中，故纖維的數(shù)量平均纖維長(zhǎng)度改變不明顯。纖維素酶用量為60～150 IU/g時(shí)，隨著纖維素酶用量增加，細(xì)小纖維含量上升，纖維的數(shù)量平均長(zhǎng)度下降。這因?yàn)槔w維素酶活力的增加，使其對(duì)纖維結(jié)晶區(qū)作用增強(qiáng)，長(zhǎng)纖維被酶解分裂成尺寸較小的纖維，故纖維的數(shù)量平均長(zhǎng)度下降［8］。

2.2 纖維素酶和半纖維素酶用量對(duì)胡蘿卜纖維平均寬度的影響

試驗(yàn)結(jié)果見表3。從表3可以看出，在纖維素酶用量一定，隨著半纖維素酶用量的增加，纖維平均寬度略有降低。這因?yàn)榘肜w維素酶酶解半纖維素和細(xì)小纖維，減少了空間阻礙，提高了纖維素酶的活力，纖維平均寬度降低。但半纖維素酶主要吸附于半纖維素和細(xì)小纖維，對(duì)纖維表面不產(chǎn)生“剝皮”效應(yīng)，故纖 維的平均寬度改變不明顯［10］。

表3 纖維素酶和半纖維素酶用量對(duì)胡蘿卜纖維平均寬度(mm)的影響

在半纖維素酶用量一定，隨著纖維素酶用量的增加，纖維素酶處理后的纖維平均寬度明顯變小。這因?yàn)槔w維素酶和半纖維素酶協(xié)同作用，使纖維表面的P層、S1層脫除，使得纖維的平均寬度降低。

2.3 纖維素酶和半纖維素酶用量對(duì)胡蘿卜纖維還原糖濃度的影響

試驗(yàn)結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，在纖維素酶用量一定，半纖維素酶用量為0～48 IU/g時(shí)，隨著半纖維素酶用量增加，還原糖濃度升高。這因?yàn)橐环矫姘肜w維素酶具有水解半纖維素和纖維素的雙重活性，對(duì)纖維素表現(xiàn)出很大的親和性，可以酶解半纖維素和細(xì)小纖維生成還原糖［9］;另一方面半纖維素和細(xì)小纖維被酶解溶出減少了空間阻礙，使得纖維素酶更容易吸附于纖維上，還原性末端的糖基被酶解脫離纖維，故還原糖濃度升高。半纖維素酶用量為48～60 IU/g時(shí)，還原糖濃度略有升高。這因?yàn)榘肜w維素酶反應(yīng)位點(diǎn)與半纖維素和細(xì)小纖維結(jié)合接近飽和，酶解產(chǎn)物與反應(yīng)物達(dá)到平衡狀態(tài)，再增加酶用量也無(wú)法使還原糖的濃度得到明顯升高。

圖1 纖維素酶和半纖維素酶用量對(duì)還原糖濃度的影響

在半纖維素酶用量一定，纖維素酶用量為30～120 IU/g時(shí)，隨著纖維素酶用量的增加，還原糖濃度升高。這因?yàn)殡S著纖維素酶用量的增加，酶解產(chǎn)量和速率增大，細(xì)小纖維被酶解溶出生成糖;另外，半纖維素酶的加入提高了纖維素酶的酶解效率，纖維素酶對(duì)纖維的無(wú)定型區(qū)和結(jié)晶區(qū)酶解作用增強(qiáng)，故纖維二糖分子和葡萄糖分子濃度升高。纖維素酶用量為120～150 IU/g時(shí)，還原糖濃度變化不明顯。這因?yàn)槔w維素分子與纖維素酶分子的結(jié)合位點(diǎn)是一定的，這些結(jié)合點(diǎn)全部被纖維素酶分子占據(jù)后，細(xì)小纖維被酶解溶出生成糖，使酶解產(chǎn)物與反應(yīng)物達(dá)到平衡狀態(tài)，故還原糖濃度變化不明顯［10］。

2.4 纖維素酶和半纖維素酶用量對(duì)胡蘿卜纖維聚合度的影響

試驗(yàn)結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，在纖維素酶用量一定，半纖維素酶用量為0～24 IU/g時(shí)，隨著半纖維素酶用量的增加，纖維聚合度升高。這因?yàn)榘肜w維素酶作用半纖維素和細(xì)小纖維，使其被酶解溶出，無(wú)定型區(qū)纖維比例減小，聚合度升高。當(dāng)半纖維素酶用量為24～60 IU/g時(shí)，纖維的聚合度明顯下降。這因?yàn)榘肜w維素和細(xì)小纖維已被酶解溶出，減少了空間位阻，使得纖維素酶更加容易吸附于纖維上，增強(qiáng)了纖維素酶對(duì)纖維的結(jié)晶區(qū)酶解作用，無(wú)定型區(qū)纖維比例增大，故纖維的聚合度下降。

圖2 纖維素酶和半纖維素酶用量對(duì)聚合度的影響

在半纖維素酶用量一定，纖維素酶用量為30～60 IU/g時(shí)，隨著纖維素酶用量的增加，纖維的聚合度變化不明顯。這因?yàn)槔w維素酶主要作用于細(xì)小纖維和纖維的無(wú)定型區(qū)，對(duì)纖維的結(jié)晶區(qū)酶解作用較弱［11］。纖維素酶用量為60～150 IU/g時(shí)，隨著纖維素酶用量的增加，纖維聚合度降低。這是因?yàn)槔w維素酶對(duì)纖維的結(jié)晶區(qū)酶解作用增強(qiáng)，無(wú)定型區(qū)纖維比例增大，纖維的聚合度降低。

3 結(jié)論

纖維素酶和半纖維素酶對(duì)纖維改性效果有很大影響，纖維素酶酶系中的外切酶(CBH)和內(nèi)切酶(EG酶)組分以及半纖維素酶的協(xié)同作用，在對(duì)纖維改性中起到了重要作用［12］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，兩者合適的用量和比例對(duì)纖維性能指標(biāo)的改善作用明顯。

(1)纖維素酶用量為60～150 IU/g和半纖維素酶用量為24～60 IU/g時(shí)，酶對(duì)胡蘿卜纖維細(xì)纖維化作用最明顯，纖維的細(xì)纖維化能夠提高纖維表面和整體的柔性;

(2)在纖維素酶用量為30～120 IU/g和半纖維素酶用量為0～48 IU/g時(shí)，酶解產(chǎn)率得到明顯提高，有助于增加胡蘿卜纖維的可溶性和可溶性固性物的含量;

(3)在纖維素酶用量為60～150 IU/g和半纖維素酶用量為24～60 IU/g時(shí)，半纖維素酶明顯增強(qiáng)纖維素酶對(duì)纖維結(jié)晶區(qū)的酶解作用，使纖維的聚合度降低，低聚合度有利于胡蘿卜纖維與天然高分子物質(zhì)發(fā)生聚合反應(yīng)。

綜上所述，纖維素酶和半纖維素酶復(fù)合使用比單一酶對(duì)胡蘿卜纖維改性效果明顯。而且利用生物酶改性胡蘿卜纖維，能夠獲得具有高活性、天然、安全和可食的纖維，可以將其應(yīng)用于新型的蔬菜紙、膳食纖維食品和可食性包裝材料中。同時(shí)，采用胡蘿卜渣為原材料不僅能增加胡蘿卜深加工的附加值、豐富可食纖維生產(chǎn)的原料來(lái)源，還有利于減小環(huán)境污染。

［1］ Park J，Park K.Improvement of the physical properties of reprocessed paper by using biological treatment with modified cellulose［J］.Bioresource Technology，2001，79(1):91－94.

［2］ Mansfield S D，Jason S D，Norm R，et al.Enhancing douglas-fir pulp properties with a combination of enzyme treatments and fiber fractionation［J］.Tappi Journal，1999，82(5):152－158.

［3］ Baker R A，Wicker L.Current and potential applications of enzyme infusion in the food industry［J］.Trends in Food Science and Technology，1996，7(9):279－284.

［4］ Bhat M K.Cellulases and related enzymes in biotechnology［J］.Biotechnology Advances，2000，18(5):355 －383.

［5］ 仇農(nóng)學(xué).現(xiàn)代果汁加工技術(shù)與設(shè)備［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2000:226－243.

［6］ 林文庭，洪華榮.胡蘿卜渣膳食纖維提取工藝及其性能特性研究［J］.糧油食品科技，2008，16(6):56－59.

［7］ Jackson L S，Heitmann J A，Joyce T W.Enzymatic modifications of secondary fiber［J］.Tappi Journal，1993，76(3):147.

［8］ 管斌，孫艷玲，謝來(lái)蘇，等.紙漿酶改性對(duì)纖維素聚合度和纖維長(zhǎng)度的影響［J］.中國(guó)造紙學(xué)報(bào)，2000，15(12):14－17.

［9］ 江正強(qiáng)，李里特，李穎.耐熱木聚糖酶研究進(jìn)展［J］.中國(guó)生物工程雜志，2003，23(8):47－51.

［10］ Chang V S，Nagwan I M，Holtzapplem T.Lime pretreatment of crop residues bagasse and wheat straw［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，1998，74(3):135－159.

［11］ 魯杰，石淑蘭，牛梅紅，等.纖維素酶酶解葦漿纖維微觀結(jié)構(gòu)和結(jié)晶結(jié)構(gòu)的變化［J］.中國(guó)造紙學(xué)報(bào)，2005，20(2):85－90.

［12］ 管斌，孫艷玲，隆言泉，等.復(fù)合纖維素酶對(duì)楊木SGW漿纖維素結(jié)晶度和微晶體尺寸的影響［J］.中國(guó)造紙學(xué)報(bào)，2000，15(1):7－11.

Study on Carrot Fiber Modification with Cellulase and Hemicellulase

Liu Huan，He Lian-bin，Wei Jing，Ma Zhong-su
(School of Biological and Agricultural Engineering，Jilin University，Changchun 130025，China)

This paper studied the influence of cellulase and hemicellulase on the length，width，sugar content and polymerization degree of carrot pomace fiber.The mechanism of synergy of cellulase and hemicellulase modified carrot fiber was analyzed.The result indicated that the complex application of cellulase and hemicellulase was more obvious effect than the single enzyme.And the synergism of cellulase and hemicellulase could improve the thin fibrosis of the fiber surface，enhance the production rate of enzymolysis fiber，and reduce the polymerization degree of the fiber.

cellulase，hemicellulase，carrot fiber

博士研究生(馬中蘇教授為通訊作者)。

*國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃:編號(hào):2008AA10Z308)和吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào):20060717)。

2010－08－09，改回日期:2010－09－27