汪鵬榮, 劉偉芬, 蔣冬花, 周 琴, 嵇 豪

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江金華 321004)

真菌多糖是從真菌子實(shí)體、菌絲體、發(fā)酵液中分離出的由 10個(gè)分子以上單糖通過糖苷鍵連接而成的高分子多聚物,是一類可以控制細(xì)胞分裂分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和衰老的活性多糖,是當(dāng)今醫(yī)藥和食品工業(yè)界共同關(guān)注的焦點(diǎn)[1].糖生物學(xué)已成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域的新前沿,糖鏈也被稱為生命科學(xué)中的第 3條鏈[2].紅曲菌 (M onascus)是一屬小型絲狀腐生真菌,屬子囊菌亞門 (Ascomycotina)不整囊菌綱 (Plectomycetes)散囊菌目 (Eurotiales)紅曲科 (Monascaceae)[3],是一種常用的藥用真菌.我國(guó)是世界上紅曲菌生產(chǎn)和應(yīng)用最早的國(guó)家,其中福建古田的紅曲最為有名,浙江、臺(tái)灣、兩廣等地區(qū)也有生產(chǎn),特別是浙江省近幾年來在紅曲的生產(chǎn)和應(yīng)用上有很大的發(fā)展.當(dāng)今國(guó)內(nèi)外對(duì)紅曲菌的研究很多,主要集中在莫納卡林 K(Monacolin K)、γ-氨基丁酸 (γ-aminobutyric acid,GABA)和紅曲色素上,但對(duì)紅曲菌的另一功能性成分——紅曲多糖的研究卻很少.

目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)靈芝多糖、香菇多糖、蟲草多糖等進(jìn)行了廣泛而深入的研究,雖然已有報(bào)道表明紅曲多糖同靈芝多糖、香菇多糖、蟲草多糖具有相似的生物學(xué)功能,但國(guó)內(nèi)對(duì)紅曲多糖的發(fā)酵生產(chǎn)工藝的研究較少,尚處于探索階段,而國(guó)內(nèi)相關(guān)研究報(bào)道的初篩紅曲菌株產(chǎn)胞外多糖的產(chǎn)量均處于較低的水平.本研究希望從浙江省不同地區(qū)分布的紅曲米中篩選出高產(chǎn)多糖的紅曲菌株.

紅曲菌屬種傳統(tǒng)的鑒定是以培養(yǎng)特征和顯微形態(tài)為主要依據(jù)的[4],分類標(biāo)準(zhǔn)的研究有很多.本實(shí)驗(yàn)從浙江省各地采集到的紅曲米中分離純化得到 111株紅曲菌,通過搖瓶發(fā)酵篩選出 6株多糖產(chǎn)量相對(duì)較高且遺傳穩(wěn)定性好的紅曲菌菌種,并對(duì)其進(jìn)行了形態(tài)學(xué)鑒定,以其對(duì)后續(xù)研究奠定基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 菌種及來源

111株紅曲菌的純培養(yǎng),分離自浙江省各地(溫州、義烏、東陽、金華、杭州等)收集到的紅曲米.

1.2 培養(yǎng)基

1)PDA培養(yǎng)基 馬鈴薯 200 g,葡萄糖 20 g,瓊脂粉 18 g,水 1 000 mL,pH自然.

2)查氏合成培養(yǎng)基 葡萄糖 30 g,NaNO33 g,酵母提取物 1 g,K2HPO41 g,KCl 0.5 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,瓊脂粉18 g,水1 000 mL,pH 6.00.

3)液體發(fā)酵培養(yǎng)基 蔗糖 40 g/L,酵母粉4.5 g/L,KH2PO4·3H2O 3.5 g/L,MgSO40.4 g/L,發(fā)酵液起始 pH 5.0[5].

4)CYA培養(yǎng)基 蔗糖 30 g,NaNO33 g,酵母提取物 5 g,K2HPO41 g,KCl 0.5 g,MgSO4·7H2O 0.05 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,瓊脂 18 g,水 1 000 mL,pH 6.0[6].

5)G25N培養(yǎng)基 NaNO33.0 g,酵母提取物5.0 g,K2HPO41 g,KCl 0.5 g,MgSO4·7H2O 0.05 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,瓊脂 15 g,補(bǔ)水至1 000 mL,待瓊脂溶化后加入 25%甘油,pH 6.0[6].

6)MEA培養(yǎng)基 麥芽浸出粉 20 g,蛋白胨1 g,葡萄糖 2 g,瓊脂 15 g,補(bǔ)水至 1 000 mL,pH 6.0[6].

1.3 紅曲菌的分離純化

分別取各地采集的紅曲米 0.5 g,用研缽研磨成粉狀,取少量均勻地灑入 PDA培養(yǎng)基表面,30℃培養(yǎng) 48 h左右,待白色絨毛狀菌絲長(zhǎng)出后挑取少許菌絲轉(zhuǎn)接于另一 PDA培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng),培養(yǎng) 1周后重復(fù)上述分離純化操作,經(jīng) 3次純化后即可得到紅曲菌的純培養(yǎng),將所獲各菌株編號(hào),置 4℃冰箱中保存,備用.

1.4 紅曲多糖的提取

1.4.1 工藝流程[7]

菌種→斜面培養(yǎng)→搖瓶培養(yǎng)→離心除雜→上清液→減壓濃縮→醇沉→離心→沉淀→鼓風(fēng)干燥→紅曲粗多糖.

1.4.2 種子液的制備

用打孔器 (直徑 0.8 cm)分別取 30℃培養(yǎng)5 d的平板菌種 (5塊)接種到查氏合成培養(yǎng)基(250 mL三角瓶裝入 50 mL查氏液體培養(yǎng)基)中,在 30℃,轉(zhuǎn)速為 200 r/min的旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)48 h.

1.4.3 紅曲菌的發(fā)酵培養(yǎng)

將上述種子液接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,接種量為 8%,250 mL三角瓶中裝 100 mL培養(yǎng)液,在 180 r/min,30℃下培養(yǎng) 96 h.

1.4.4 紅曲粗多糖的測(cè)定

采用質(zhì)量法[8].將發(fā)酵濾液定容至 100 mL,取 15 mL加入 60 mL無水乙醇中,在 5℃下靜置8 h,過濾,在 80℃烘干 12 h至恒重,稱量.

1.4.5 生物量的測(cè)定[8]

紅曲菌經(jīng)搖床培養(yǎng)后,用 8層紗布過濾,得到的菌體在 80℃下烘干 12 h至恒重,稱量.

1.5 不同菌株菌絲生長(zhǎng)速度的比較

采用 PDA斜面培養(yǎng)基,每個(gè)菌株接 3個(gè)平板,30℃恒溫培養(yǎng),5 d后測(cè)量各菌株的菌落直徑,取平均值作為不同菌株的菌絲生長(zhǎng)速度.

1.6 高產(chǎn)多糖紅曲菌株生理生化特征的檢測(cè)

1.6.1 生長(zhǎng)溫度

將紅曲菌株分別用打孔器接種到麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上,培養(yǎng)溫度分別為 20,25,30,35和40℃,培養(yǎng) 5 d后觀察菌落直徑大小.

1.6.2 生長(zhǎng) pH條件

配制 pH分別為 3,4,5,6,7,8的查氏固體培養(yǎng)基.將紅曲菌株分別用打孔器接種到查氏固體培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 5 d后觀察菌落直徑大小.

1.6.3 碳源

以不含糖的查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,供試糖分別為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、番薯粉、可溶性淀粉、甘油,各種糖的加量均為 3%,配制好培養(yǎng)基后滅菌接種,30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 5 d后觀察結(jié)果.

1.6.4 氮源

以不含NaNO3的查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,供試氮源為 (NH4)2SO4,NaNO3,蛋白胨、牛肉浸膏、酵母粉,在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入不同氮源,加量為 0.3%,配制好培養(yǎng)基后滅菌接種,30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 5 d后觀察結(jié)果.

1.7 紅曲菌屬種鑒定

將搖瓶發(fā)酵篩選出的 6株高產(chǎn)胞外多糖紅曲菌菌種分別接種在上述MEA,CYA和 G25N培養(yǎng)基中,在 25℃培養(yǎng) 7,14和 25 d后觀察記錄菌落生長(zhǎng)特征 (如:大小、顏色、表面結(jié)構(gòu)、氣生菌絲、基內(nèi)菌絲、邊緣特征、生長(zhǎng)與否、培養(yǎng)基內(nèi)可溶性色素等).根據(jù)文獻(xiàn) [4]中紅曲菌分種檢索表,并參考葉硯等[9]和郭紅珍等[10]的描述,對(duì)篩選的 6株高產(chǎn)多糖菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定.

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲菌種的分離純化

經(jīng)分離純化,獲得 111株紅曲菌.大部分紅曲菌菌落大而疏松,表層有氣生菌絲,呈絨墊狀,少數(shù)為皮膜狀;菌落大多色澤橙紅,少數(shù)為白色;菌落邊緣為白色,或淡黃色,背面顏色為深紅色.

2.2 產(chǎn)多糖紅曲菌的初篩

按上述多糖提取方法,對(duì) 111株紅曲菌進(jìn)行產(chǎn)多糖的初篩,結(jié)果見圖 1.由圖 1可知,大多數(shù)紅曲菌胞外多糖產(chǎn)量都較低,多為 1.0～3.0 g/L(占 72.7%).其中多糖產(chǎn)量在 5.0 g/L以上的只有 6株,分別為編號(hào) MP-25,MP-45,MP-66,MP-70,MP-85和MP-99的菌株.

圖 1 111株紅曲菌胞外粗多糖產(chǎn)量的分布圖

2.3 高產(chǎn)胞外多糖紅曲菌株的復(fù)篩

對(duì)初篩出的 6株高產(chǎn)胞外多糖的紅曲菌株進(jìn)行了 3次重復(fù)搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn),結(jié)果 (見表 1)表明:僅菌株MP-66胞外多糖產(chǎn)量最高為 5.28 g/L;而且在重復(fù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)菌株MP-66的多糖產(chǎn)量穩(wěn)定在 5.00 g/L以上,而其他 5株初篩高產(chǎn)多糖菌株的胞外多糖產(chǎn)量不是很穩(wěn)定,有較大幅度波動(dòng).因此,選定菌株MP-66為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的目的菌株.

表 1 6株高產(chǎn)胞外多糖紅曲菌株的平均多糖產(chǎn)量

2.4 菌絲生長(zhǎng)速度和生物量的比較

對(duì) 6株初篩高產(chǎn)胞外多糖的紅曲菌株在平板培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)速度和在發(fā)酵液中菌絲體生物量的比較結(jié)果 (見表 2)表明:不同菌株在平板和液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)性能存在明顯的差異,有 3個(gè)菌株 (MP-25,MP-66和MP-85)在平板培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率較其他菌株快;而在發(fā)酵液的生物量方面,菌株MP-45最高達(dá) 14.04 g/L,其次為菌株MP-66和MP-25.因此,從菌株的生長(zhǎng)速度和生物量方面考慮,并結(jié)合其胞外多糖的產(chǎn)量,選取高產(chǎn)胞外多糖的紅曲菌株MP-66用于今后進(jìn)一步的研究.

表 2 6株高產(chǎn)多糖紅曲菌株平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度和液體發(fā)酵菌絲體生物量的比較

2.5 高產(chǎn)多糖紅曲菌株生理生化特征的比較

2.5.1 菌株生長(zhǎng)溫度

從表 3可以看出:6株高產(chǎn)多糖的紅曲菌株在20～40℃均能生長(zhǎng);在 30～35℃生長(zhǎng)最快;在20℃下生長(zhǎng)緩慢;大多數(shù)菌株在 40℃下生長(zhǎng)很緩慢,而 MP-66和 MP-70在 40℃仍能較好地生長(zhǎng).由此可見,MP-66和MP-70可能屬于耐高溫型紅曲菌.

2.5.2 菌株生長(zhǎng) pH

從表 4可知,6株高產(chǎn)多糖的紅曲菌株在 pH 3～8均能生長(zhǎng),其最適生長(zhǎng) pH為 5～6.因此,紅曲菌一般在弱酸性環(huán)境下培養(yǎng)最好.

2.5.3 菌株碳源利用

由表 5可知:6株高產(chǎn)多糖的紅曲菌株均能較好地利用蔗糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉和番薯粉,其中 5株紅曲菌能很好地利用乳糖和番薯粉,只有MP-85的最適碳源為麥芽糖;而對(duì)于葡萄糖,這 6株紅曲菌都未能達(dá)到最佳生長(zhǎng)狀態(tài),原因可能是葡萄糖在滅菌過程中發(fā)生了焦糖化作用.MP-25和MP-70能在甘油中生長(zhǎng),其他 4個(gè)菌株在甘油中不能生長(zhǎng)或者生長(zhǎng)得不好.因此,紅曲菌株對(duì)甘油的利用情況在紅曲菌的分類鑒定上有一定的參考價(jià)值.

表 3 不同溫度下 6株高產(chǎn)多糖菌株的生長(zhǎng)情況

表 4 6株高產(chǎn)多糖紅曲菌株在不同 pH條件下的生長(zhǎng)情況

表 5 6株高產(chǎn)多糖紅曲菌株的碳源利用實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.4 菌株氮源利用

由表 6可知,6株高產(chǎn)多糖的紅曲菌株對(duì)氮源的利用差別不大,均能利用表 6中的 5種氮源,但它們?cè)谟袡C(jī)氮源中明顯較無機(jī)氮源中生長(zhǎng)更好.

2.6 高產(chǎn)多糖菌株菌落特征和顯微特征的比較

6株高產(chǎn)多糖的紅曲菌株在 CYA,MEA和G25N培養(yǎng)基上 25℃培養(yǎng) 7,14 d后觀察記錄菌落特征.6株紅曲菌在MEA和 CYA培養(yǎng)基上培養(yǎng) 14 d的代表性菌落特征見表 7;在 CYA,MEA,PDA培養(yǎng)基上的代表性菌落特征見圖 2.

表 6 6株高產(chǎn)多糖紅曲菌株的氮源利用實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表 7 6株高產(chǎn)多糖紅曲菌在MEA和 CYA培養(yǎng)基上的菌落特征 (14 d)

圖 2 6株高產(chǎn)多糖紅曲菌株在 CYA,MEA,PDA培養(yǎng)基上的菌落特征

6株高產(chǎn)多糖紅曲菌株在 30℃下 PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng) 7 d,顯微鏡觀察菌絲形態(tài)、分生孢子形態(tài)及著生方式、閉囊殼特征等顯微形態(tài)特征,部分代表性結(jié)果如圖 3所示.

由圖 3可見紅曲菌各菌株的典型顯微形態(tài)特征:閉囊殼為橢球形 (見圖 3(a)),直徑為 20～50 μm,閉囊殼內(nèi)散生眾多子囊,成熟后子囊壁解體,孢子剩留在薄壁的子囊殼內(nèi);分生孢子梗由菌絲生出,在其頂部產(chǎn)生分生孢子 (見圖 3(b)),形狀為梨形;菌絲直徑 2～7μm,具橫隔,分枝狀,含有空泡和一些色素顆粒 (見圖 3(c)).

圖 3 紅曲菌顯微形態(tài)特征

根據(jù) 6株高產(chǎn)多糖的紅曲菌株菌落特征和顯微特征,初步將 6株高產(chǎn)多糖的紅曲菌株鑒定為表 8所列的 4個(gè)種.

表 8 6株高產(chǎn)多糖紅曲菌株的鑒定結(jié)果

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)從 111株紅曲菌中最終篩選出一株多糖產(chǎn)量穩(wěn)定在 5.0 g/L以上的高產(chǎn)多糖紅曲菌株,其平均胞外多糖產(chǎn)量為 5.28 g/L,比目前國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的高,而且該菌株在平板和搖瓶培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度快,在工業(yè)化生產(chǎn)中可以縮短發(fā)酵周期、節(jié)約生產(chǎn)成本.今后,本課題還將對(duì)該高產(chǎn)多糖紅曲菌株進(jìn)一步研究,提高多糖產(chǎn)量,確定其最佳發(fā)酵條件和最佳培養(yǎng)基配方,以期對(duì)紅

曲多糖的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ).雖然本文結(jié)合了較多的紅曲菌形態(tài)學(xué)鑒定資料并參考生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果,最終將高產(chǎn)多糖的紅曲菌株MP-66鑒定為紫色紅曲菌,但形態(tài)學(xué)鑒定由于受環(huán)境因素的影響較大,存在一定的主觀性,因此本課題還將從分子水平對(duì)該菌株進(jìn)行屬種的確認(rèn).

目前市售的很多保健產(chǎn)品中都含有多糖成分,但大多集中在靈芝多糖和香菇多糖等少數(shù)食用菌多糖上.張建峰[11]對(duì)紅曲多糖的免疫活性進(jìn)行了探索,結(jié)果表明紅曲多糖同其他真菌多糖一樣具有提高免疫力、保肝解毒等作用.浙江省是國(guó)內(nèi)紅曲分布較多的省份,因此,我們可以充分利用浙江省的紅曲資源,分離純化出高產(chǎn)多糖的紅曲菌菌株,并對(duì)其進(jìn)行屬種的鑒定,為今后進(jìn)一步研究紅曲多糖的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系、浙江省紅曲菌資源的分布及多樣性打下基礎(chǔ).

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