徐麗珊, 黃啟亮, 吳振珍

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江金華 321004)

原花青素 (proanthocyanidin)是廣泛存在于植物的葉、花、果、皮中的天然多酚化合物,是目前國(guó)際上公認(rèn)的天然抗氧化劑,具有較強(qiáng)的抗氧化活性,并能預(yù)防心血管疾病,抗腫瘤、抗輻射[1-5].原花青素以其高效、低毒、高水溶性、高生物利用率等特點(diǎn)越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注[6-8],并在食品、化妝品領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用.

目前市場(chǎng)上的原花青素主要從葡萄籽和松樹(shù)皮中提取.其中葡萄籽來(lái)源有限;我國(guó)松屬植物資源雖然豐富,但松樹(shù)皮的采集不利于松樹(shù)的生長(zhǎng).松針是一種可持續(xù)利用的天然再生資源,目前關(guān)于松針中的活性成分已有一些研究[9-11],但有關(guān)松針中原花青素提取的報(bào)道很少.為了更好地利用松針資源,充分開(kāi)發(fā)松針中的原花青素,有必要從浙江省分布較多的馬尾松、濕地松、黑松的松針中篩選原花青素含量最高的松針,并對(duì)其中原花青素的提取工藝進(jìn)行研究.

目前,對(duì)植物中原花青素的提取方法研究較多的有:水浸提法、有機(jī)溶劑提取法等[12-13].產(chǎn)業(yè)化原花青素提取純化方法的發(fā)展趨勢(shì)應(yīng)該是得率高、成本低、方法簡(jiǎn)便、綠色環(huán)保.本實(shí)驗(yàn)的目的就是要篩選出一條操作簡(jiǎn)便、成本低、得率高、所用溶劑綠色、環(huán)保的從松針中提取原花青素的工藝路線(xiàn),為大量生產(chǎn)原花青素及松針的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

濕地松 (Pinus elliottiiEngel m.)松針、馬尾松(Pinus m assonianaLamb.)松針和黑松 (Pinus thunbergiiParl.)松針均采自浙江師范大學(xué)校園內(nèi),中齡,采樣部位為樹(shù)干的中下部、樹(shù)枝的中部.

原花青素標(biāo)準(zhǔn)品 (純度≥95%)購(gòu)自天津尖峰天然產(chǎn)物有限公司.

1.2 松針提取液的制備

稱(chēng)取一定量剪成 0.5～1 cm長(zhǎng)度的松針,按一定的料液比加入提取劑,恒溫浸提一定時(shí)間,過(guò)濾,定容至一定體積,測(cè)定原花青素的含量.提取液中原花青素的量與所稱(chēng)取的新鮮松針的量的比值為原花青素的得率.

1.3 原花青素含量的測(cè)定

采用硫酸-香草醛法[14].

1.4 松針提取液的紫外分析

將上述松針提取液及原花青素標(biāo)準(zhǔn)品在紫外區(qū)下掃描比較.

1.5 單因素實(shí)驗(yàn)與正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

選用提取溫度、提取時(shí)間、料液比和酸堿度作為單因素實(shí)驗(yàn)的考察因素.

利用單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采用 L9(34)正交表,以原花青素得率作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定松針中原花青素的最佳提取條件.

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次以上,數(shù)據(jù)以 x ±s表示,采用 SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 松針品種的確定

取等量的馬尾松、濕地松和黑松松針,分別按照料液比為 1∶8加水,在 60℃浸提 1 h,比較在該提取條件下不同品種松針的原花青素得率,確定提取原花青素的松針品種,結(jié)果見(jiàn)表 1.

表 1 相同條件提取 3種松針中原花青素的得率

從表 1可以看出,在相同提取條件下,3種松針原花青素得率的高低順序?yàn)?濕地松 >黑松 >馬尾松.在 3種水提液中,濕地松松針的原花青素含量最高,且顯著高于其他 2種松針的含量.因此,選用濕地松松針作為以后研究的對(duì)象.

2.2 松針處理方式的確定

取等量的濕地松松針 3份,分別用新鮮 (洗凈瀝干)、自然晾干 (室溫陰干)、烘箱烘干 (50℃烘箱)3種不同方法處理,再按照料液比為 1∶8加水,60℃提取 1 h,測(cè)定松針原花青素的提取率,確定提取松針原花青素的原料處理方式,結(jié)果見(jiàn)圖 1.可以得出,新鮮松針的原花青素提取率顯著高于自然晾干和烘箱烘干的.故以新鮮松針為工藝優(yōu)化的原料.

圖 1 松針不同處理方式對(duì)原花青素提取的影響

2.3 提取溶劑的確定

取等量的新鮮濕地松松針,分別按照料液比為 1∶8加入 10%,30%,50%,70%,90%的乙醇溶液,以加入等量的自來(lái)水 (不含醇)為對(duì)照,置于 40℃的水浴鍋中浸提 1 h,測(cè)定松針原花青素的得率,結(jié)果見(jiàn)圖 2.

2 不同含量乙醇溶液對(duì)原花青素提取的影響

由圖 2可知:在含醇量為 0～30%時(shí),松針原花青素的提取率隨乙醇含量的增大而提高;但當(dāng)乙醇含量大于 50%以后,原花青素的提取率開(kāi)始下降.說(shuō)明在40℃提取時(shí),以 50%乙醇溶液的提取效果最好.

取等量的濕地松松針 2份,分別按照料液比為 1∶8加入 50%乙醇溶液和自來(lái)水,均置于80℃水浴中浸提 1 h,測(cè)定松針原花青素的得率,結(jié)果見(jiàn)表 2.

表 2 不同溶劑對(duì)原花青素提取的影響 (80℃)

從表 2可知,在 80℃水浴中,松針用自來(lái)水提取原花青素的得率顯著高于 50%乙醇溶液的提取率.并且,以水為提取溶劑,操作簡(jiǎn)單易行,安全環(huán)保,經(jīng)濟(jì)有效.因此,選用水提法作為工藝優(yōu)化的提取方法.

2.4 松針提取液的紫外分析

對(duì)松針提取液進(jìn)行紫外掃描,結(jié)果見(jiàn)圖 3.

圖 3 松針提取液的紫外掃描結(jié)果

從圖 3可以看出,松針提取液與原花青素標(biāo)準(zhǔn)品的紫外吸收較接近,均在 280 nm左右波長(zhǎng)處有較大吸收.由此判斷,松針提取液中含有原花青素,只是提取液中的原花青素含量沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品高,所以吸收值沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品的大.

2.5 水提法最佳工藝條件的確定

2.5.1 單因素實(shí)驗(yàn)

在其他條件一致的情況下,研究了不同的提取溫度、提取時(shí)間、pH及料液比對(duì)水提取松針中原花青素的影響.

2.5.1.1 提取溫度的影響

取等量的濕地松松針,按照料液比為 1∶8加水,分別在 50,60,70,80,90,100℃下提取 1 h,測(cè)定原花青素的得率,結(jié)果見(jiàn)圖 4.

圖 4 提取溫度對(duì)原花青素提取的影響

由圖 4可知,隨著提取溫度的升高,原花青素的得率呈增加的趨勢(shì).

2.5.1.2 料液比的影響

取等量的濕地松松針,分別按照料液比為1 ∶8,1 ∶10,1 ∶12,1 ∶14,1 ∶16加水,在80℃提取 1 h,測(cè)定原花青素的得率,結(jié)果見(jiàn)圖 5.

圖 5 料液比對(duì)原花青素提取的影響

由圖 5可知,隨液料比的增加,原花青素的得率隨之提高,當(dāng)料液比為 1∶14之后,趨勢(shì)稍微平緩.考慮到后續(xù)加工中濃縮的成本,液料比選擇不宜過(guò)高.

2.5.1.3 pH的影響

取等量的濕地松松針,按照料液比為 1∶8分別加入 pH為 4,6,8,10的水,80℃提取 1 h,測(cè)定原花青素的得率,結(jié)果見(jiàn)圖 6.

圖 6 pH對(duì)原花青素提取的影響

由圖 6可知,隨 pH值的增大,原花青素的得率急劇下降,以 pH為 4時(shí)的提取效果為最好.

2.5.1.4 提取時(shí)間的影響

取等量的濕地松松針,按照料液比為 1∶8加水,在80℃分別提取30,60,90,120,150,180 min,測(cè)定原花青素的得率,結(jié)果見(jiàn)圖 7.

圖 7 提取時(shí)間對(duì)原花青素提取的影響

從圖 7可以看出:隨著提取時(shí)間的增加,原花青素的得率呈增加的趨勢(shì).提取時(shí)間在 30～120 min時(shí),原花青素的得率幾乎呈直線(xiàn)上升;在120～180 min時(shí),原花青素的得率變化不大.

2.5.2 正交實(shí)驗(yàn)

在上述單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以原花青素提取率為指標(biāo),采用正交表 L9(34)進(jìn)行優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn),因素水平選取如表 3所示,正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析見(jiàn)表 4.

表 3 正交實(shí)驗(yàn)因素和水平

表 4 松針原花青素提取正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表 4可知,從松針中提取原花青素的最好設(shè)計(jì)方案為 A3B3C3D1,即最佳工藝條件為 pH 4,提取溫度 100℃,提取時(shí)間 150 min,料液比1∶14.

2.5.3 最佳提取工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為驗(yàn)證所選工藝為最佳優(yōu)化工藝,在最優(yōu)條件下進(jìn)行了 3次平行實(shí)驗(yàn),所得濕地松松針原花青素的提取率見(jiàn)表 5.

表 5 最佳工藝條件下松針原花青素的得率

由表 5可以知道,A3B3C3D1條件下松針原花青素的得率確實(shí)高于表 4中每一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定A3B3C3D1為最佳工藝優(yōu)化組合.

3 結(jié)論與討論

1)馬尾松、濕地松和黑松 3種浙江省常見(jiàn)的松針中,以濕地松松針為原料提取原花青素得率最高;

2)比較了新鮮、晾干、烘干 3種處理方式,結(jié)果表明用新鮮松針提取原花青素得率最高;

3)從操作簡(jiǎn)便、有效、成本低、所用溶劑綠

色、環(huán)保等因素考慮,水提法提取濕地松松針中的原花青素優(yōu)于乙醇提取法;

4)通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定了濕地松松針中原花青素的最佳提取工藝條件:提取溫度 100℃,提取時(shí)間 150 min,pH=4,料液比1∶14(g/mL).在此工藝條件下,濕地松松針原花青素得率為 (33.415±0.286)mg/g.

原花青素為極性物質(zhì),常用的溶劑為水、甲醇、乙醇、丙酮等.在選擇提取溶劑時(shí)必須考慮溶解度、安全性、經(jīng)濟(jì)性等因素,故不考慮甲醇、丙酮等試劑,而以乙醇、水為溶劑設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn).

本實(shí)驗(yàn)篩選出了一條操作簡(jiǎn)便、成本低、得率高、綠色環(huán)保的從濕地松松針中提取原花青素的最佳工藝路線(xiàn).我國(guó)從 20世紀(jì) 70年代中后期到20世紀(jì) 90年代中后期,在許多地方種植了大面積的濕地松,形成了多個(gè)人工濕地松林區(qū)[15],這種既廣泛又相對(duì)較集中的分布極有利于松針原花青素的加工利用.

本實(shí)驗(yàn)主要研究了松針原花青素的最佳提取工藝,還沒(méi)有對(duì)提取所得的松針原花青素進(jìn)一步純化,有待今后進(jìn)一步研究.

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