邵鄰相, 呂學(xué)維, 鄧 剛, 張均平,徐玲玲, 麻艷芳, 畢潔瓊

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江金華 321004)

佛手 (fingered citron),學(xué)名 Citrus m edicaL.var.sarcodactylis(Noot.)Swingle,為蕓香科柑橘屬香椽 (Citrus m edicaL.)的變種,又名佛手柑、佛手香櫞、蜜羅柑等.佛手性溫味辛、苦、酸,具理氣止嘔、和胃健脾、止咳化痰等功效[1].現(xiàn)代研究表明佛手有增強機體免疫力[2]、抑制小鼠移植性肝腫瘤生長[3]、保護正常細(xì)胞[4]和抑菌[5]等多種藥用功能.但有關(guān)佛手對體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞及其酪氨酸酶活性影響的研究尚鮮見報道.本實驗研究了佛手揮發(fā)油對體外培養(yǎng)的 B16黑色素瘤細(xì)胞增殖及其酪氨酸酶活性的影響,為進一步擴大佛手在藥品、化妝品、食品等方面的應(yīng)用提供重要依據(jù).

1 材料與方法

1.1 佛手揮發(fā)油制備與處理

將金佛手果實洗凈后切塊,機械勻漿,水蒸氣回流裝置中提取揮發(fā)油.無水硫酸鈉干燥,過濾,滅菌后稱取 100 mg揮發(fā)油,加入 10μL無菌吐溫-80,渦旋振蕩混勻后用磷酸鹽緩沖液 (PBS)稀釋至 1 mL,渦旋振蕩混勻,4℃避光保存.

1.2 試劑

RPM I1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶為美國 Gibco BRL公司產(chǎn)品;新生牛血清購自杭州四季青生物工程材料公司;臺盼藍(lán)、吖啶橙 (AO)、溴化乙錠(EB)、吐溫 -80、左旋多巴 (L-DOPA)、曲拉通 X-100(Triton X-100)均為 Sigma公司產(chǎn)品.

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

B16黑色素瘤細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所.細(xì)胞接種在含 10%新生牛血清的RPM I1640培養(yǎng)基 (含 100μg·mL-1青霉素,100 μg·mL-1鏈霉素)中,37℃,5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng),細(xì)胞貼壁生長,用 1 g/L胰酶溶液與0.2 g/LEDTA溶液 (體積比 1 ∶1)消化傳代,取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗.

2×105cell/mL B16細(xì)胞接種于放有蓋玻片的 6孔板中,常規(guī)培養(yǎng) 12 h后加入佛手揮發(fā)油,使其終質(zhì)量濃度為 62.50,125.00,250.00和500.00μg·mL-1,并設(shè)置 0.005%吐溫-80作為助溶劑對照組,待藥物作用 6 h后取出細(xì)胞爬片,進行各項指標(biāo)檢測.

1.4 臺盼藍(lán)排斥法測定細(xì)胞存活率

用 0.4%臺盼藍(lán)試液染色 1 min,計數(shù) 200個細(xì)胞,正常細(xì)胞拒染,死細(xì)胞染為藍(lán)色,根據(jù)細(xì)胞計數(shù)結(jié)果計算細(xì)胞存活率,并計算半數(shù)抑制濃度(IC50).

細(xì)胞存活率 =(存活細(xì)胞數(shù) /細(xì)胞總數(shù))×100%.

1.5 瑞-姬氏混染法觀察細(xì)胞形態(tài)

取出細(xì)胞爬片,用新鮮配制的甲醇 ∶冰乙酸(體積比 3 ∶1)固定液 4℃固定 1 h,滴加瑞-姬氏染色液 100μL,染色 3 min,用蒸餾水將染液沖凈后在倒置顯微鏡下觀察拍照.

1.6 AO/EB熒光染色法觀察細(xì)胞核形態(tài)

采用文獻 [6]的方法進行染色,在熒光顯微鏡下觀察拍照.

1.7 酪氨酸酶活性檢測

參照文獻 [7]的方法并略有改進:62.50,125.00,250.00和 500.00μg·mL-1佛手揮發(fā)油處理細(xì)胞 6 h后,收集各組細(xì)胞用臺盼藍(lán)排斥法計數(shù)活細(xì)胞數(shù),用 1 mL PBS重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為 5×105cell/mL,取 0.5 mL細(xì)胞懸液于2 mL離心管中,每管加 1%Triton X-100溶液200 μL,迅速于 -80℃冷凍 30 min,隨后 37℃水浴10 min使細(xì)胞完全破裂,然后加入 10 g/LLDOPA溶液 50μL,同時用L-DOPA自動氧化作為校準(zhǔn),37℃反應(yīng) 2 h,以不加藥液細(xì)胞作為對照,以 0.005%的吐溫-80作為助溶劑對照.將上述離心管中含有活性酪氨酸酶的細(xì)胞裂解物加入 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔 100μL,每組設(shè) 3個復(fù)孔,酶標(biāo)儀 475 nm波長處測吸光度值.

1.8 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)以 x ±s表示,采用 SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行 t檢驗和單因素方差分析.

2 結(jié) 果

2.1 佛手揮發(fā)油對 B16細(xì)胞存活率的影響

臺盼藍(lán)排斥法測定結(jié)果如表 1所示,0.005%吐溫-80組 B16細(xì)胞存活率與對照組比較無顯著性差異 (P>0.05);62.50,125.00,250.00 μg·mL-1佛手揮發(fā)油處理 B16細(xì)胞 6 h,B16細(xì)胞存活率分別為 (80.67±1.61)%,(49.33±1.76)%和 (29.17±1.26)%,與對照組比較均顯著下降 (P<0.01);500.00μg·mL-1佛手揮發(fā)油處理 B16細(xì)胞 6 h后,B16細(xì)胞的存活率為(3.17±0.76)%,細(xì)胞幾乎全部死亡.隨著佛手揮發(fā)油質(zhì)量濃度的增大,B16細(xì)胞存活率降低,抑制作用增強,并呈劑量依賴性.IC50值為(148.528±0.005)μg·mL-1.

2.2 佛手揮發(fā)油對 B16細(xì)胞形態(tài)的影響

2.2.1 瑞-姬氏混染倒置顯微鏡觀察

如圖 1所示,對照組與 0.005%吐溫-80組的B16細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,多呈梭形,分裂相較多,細(xì)胞透明度較高,生長狀態(tài)良好;62.50μg·mL-1佛手揮發(fā)油處理細(xì)胞 6 h后,B16細(xì)胞成團生長,細(xì)胞間界限不清晰;125.00μg·mL-1和 250.00 μg·mL-1佛手揮發(fā)油處理 B16細(xì)胞后,多數(shù)細(xì)胞核固縮,染色質(zhì)凝集呈塊狀;500.00μg·mL-1佛手揮發(fā)油處理 B16細(xì)胞后,細(xì)胞膜完整性破壞,大部分細(xì)胞溶解成碎片,說明細(xì)胞已壞死.

2.2.2 AO/EB熒光染色觀察

熒光染色中,AO能透過胞膜完整的細(xì)胞,嵌入細(xì)胞核DNA,使之發(fā)出明亮的綠色熒光;EB僅能透過胞膜受損的細(xì)胞,嵌入核 DNA,使之發(fā)出橘紅色熒光.凋亡的細(xì)胞呈現(xiàn)為染色增強,熒光更為明亮,均勻一致的圓狀或固縮狀、團塊狀結(jié)構(gòu).非凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)熒光深淺不一的結(jié)構(gòu)樣特征.圖 2顯示:對照組和 0.005%吐溫-80組經(jīng) AO/EB染色后,在熒光顯微鏡下可見細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、胞膜完整,呈均勻一致的綠色熒光 (見圖 2中 A和B);62.50μg·mL-1佛手揮發(fā)油處理后,B16細(xì)胞核呈黃綠色,核染色質(zhì)濃縮聚集于核膜內(nèi)側(cè),呈早期細(xì)胞凋亡特征 (見圖 2中 C);125.00 μg·mL-1和 250.00μg·mL-1佛手揮發(fā)油處理后,B16細(xì)胞體積縮小,部分細(xì)胞核破裂,細(xì)胞核染色質(zhì)為 EB所染橘紅色并呈固縮狀或圓珠狀(見圖 2中 D和 E);500.00μg·mL-1佛手揮發(fā)油處理 B16細(xì)胞后,細(xì)胞膜完整性破壞,細(xì)胞核被 EB染成深紅色,出現(xiàn)細(xì)胞碎片,說明細(xì)胞已壞死 (見圖 2中 F).

表 1 佛手揮發(fā)油對B16細(xì)胞存活率的影響 (x ±s,n=3)

圖 1 瑞-姬氏混染觀察佛手揮發(fā)油對 B16細(xì)胞形態(tài)的影響

圖 2 AO/EB染色觀察佛手揮發(fā)油對B16細(xì)胞核形態(tài)的影響

2.3 佛手揮發(fā)油對 B16細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響

從表 2可見,0.005%吐溫-80組與 62.50 μg·mL-1佛手揮發(fā)油處理組 B16細(xì)胞酪氨酸酶活性與對照組比較無顯著性差異;125.00,250.00和 500.00μg·mL-1佛手揮發(fā)油處理組 B16細(xì)胞酪氨酸酶活性與對照組比較均有顯著下降 (P<0.05),說明 125.00,250.00和 500.00μg·mL-1佛手揮發(fā)油對 B16細(xì)胞酪氨酸酶活性具有一定的抑制作用,且隨著藥物質(zhì)量濃度的升高,抑制作用增強.

表 2 佛手揮發(fā)油對B16細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響 (x±s,n=3)

3 討 論

惡性腫瘤是目前危害人類健康的主要疾病之一.天然中藥以其療效廣泛、毒性低、副作用小而受到國內(nèi)外廣泛關(guān)注.中國是世界公認(rèn)的天然藥物大國,有用中草藥治病的悠久歷史.

佛手作為傳統(tǒng)名貴中藥,具有止咳化痰和理氣和中等功效[8-9].佛手品種較多,其中以產(chǎn)自金華的金佛手品質(zhì)最為優(yōu)良.浙江金華佛手的特點是:果形奇異小巧,留香持久,揮發(fā)油含量高[10].趙磊等[11]對 12種金華佛手揮發(fā)油成分的比較研究發(fā)現(xiàn),其主要成分為檸檬烯和γ-松油烯.本實驗選用金華佛手為實驗材料.

細(xì)胞凋亡是一種重要的細(xì)胞死亡方式,目前為止形態(tài)學(xué)鑒定是檢測細(xì)胞凋亡最可靠的方法.本實驗采用瑞-姬氏混染倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化;用AO/EB染色熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡,該方法能對正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞作出準(zhǔn)確的判斷,被公認(rèn)為是檢測細(xì)胞凋亡的一個定性定量指標(biāo)[12-13].

本實驗結(jié)果表明,佛手揮發(fā)油對 B16黑色素瘤細(xì)胞生長具有顯著的抑制作用,揮發(fā)油濃度越高抑制率越大,呈劑量依賴性 (見表 1).低劑量(62.50μg·mL-1)佛手揮發(fā)油處理 B16細(xì)胞 6 h

后,細(xì)胞存活率在 80%以上;倒置顯微鏡觀察到B16細(xì)胞成團生長,細(xì)胞狀態(tài)較差;熒光顯微鏡下可見細(xì)胞核呈黃綠色,核染色質(zhì)凝集于核膜內(nèi)側(cè),表明細(xì)胞發(fā)生早期凋亡.中劑量 (125.00,250.00 μg·mL-1)佛手揮發(fā)油處理 B16細(xì)胞 6 h后,倒置顯微鏡下可見細(xì)胞核固縮,染色質(zhì)凝集;熒光顯微鏡下可見細(xì)胞體積縮小,細(xì)胞核被染成橘紅色,核染色質(zhì)固縮,表明細(xì)胞已進入晚期凋亡.高劑量(500.00μg·mL-1)佛手揮發(fā)油處理 B16細(xì)胞6 h后,大部分細(xì)胞為臺盼藍(lán)染成深藍(lán)色,倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞膜破裂,部分細(xì)胞裂解成細(xì)胞碎片;熒光顯微鏡下可見細(xì)胞核為 EB染成紅色,部分細(xì)胞呈碎片狀,表明細(xì)胞已壞死.

另外,細(xì)胞酪氨酸酶活性檢測結(jié)果顯示佛手揮發(fā)油能夠顯著抑制細(xì)胞酪氨酸酶的活性.酪氨酸酶是黑色素合成最關(guān)鍵的限速酶,它的活性越高,生成的黑色素越多.佛手揮發(fā)油作為一種天然產(chǎn)物,對人體無毒,并且具有抑制酪氨酸酶活性的作用,因此在美容領(lǐng)域具有很大的開發(fā)潛力.

綜上所述,佛手揮發(fā)油具有抑制體外培養(yǎng)的B16黑色素瘤細(xì)胞增殖的作用,并能夠抑制細(xì)胞酪氨酸酶的活性,低、中劑量的佛手揮發(fā)油能夠誘導(dǎo)B16黑色素瘤細(xì)胞凋亡,高劑量的佛手揮發(fā)油可引起細(xì)胞壞死.

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