孫 偉(綜述)，史冬泉，蔣 青(審校)

(南京醫(yī)科大學附屬鼓樓臨床醫(yī)學院關節(jié)中心，南京210008)

microRNA(miRNA)是近年來發(fā)現的一種能調節(jié)基因表達的小分子RNA，參與生物體的正常生長發(fā)育及腫瘤、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、肝炎等疾病狀態(tài)過程。檢測血清miRNA表達譜對疾病的診斷、療效判定及預后評估等方面有重要的臨床意義。血清miRNA主要的檢測方法有克隆測序、RNA印跡雜交、基因芯片、反轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcrip-tion polymerase chain reaction，RT-PCR)技術。目前，該項檢測已在實驗室及臨床得到較廣泛應用。

1 miRNA形成

miRNA是一組單鏈的、非編碼的長度為21～25個單位的miRNA，在生物進化和疾病發(fā)展過程中起著調控作用。大量的mRNA被認為是miRNAs的靶向目標，并且一種 miRNA 可以靶向多種 mRNA［1，2］。miRNA在動物體內的形成過程大致如下:細胞核內編碼miRNA的基因首先在RNA聚合酶Ⅱ的作用下形成初級轉錄物 pri-miRNA［3］，pri-miRNA 在一種RNaseⅢ核酸酶作用下剪切miRNA前體pre-miRNA［4］。pre-miRNA在Dicer酶的作用下轉化為成熟的miRNA。miRNA與靶信使RNA(mRNA)3'非翻譯區(qū)(UTR)特異性地結合從而使其降解或者抑制其翻譯［5］，進一步來調控基因表達。miRNA參與生命過程中一系列的重要進程，包括早期胚胎發(fā)育、細胞增殖和細胞凋亡、脂肪代謝、細胞分化、神經分化、病毒感染機制及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等方面［6］。

2 血清miRNA的特點及檢測

RNA分子易于降解，這在一定程度上限制了體液中RNA分子作為生物標志物的應用。但是前一階段的大量研究表明，血清中存在著穩(wěn)定miRNA［7-10］，血清miRNA在室溫、高溫、不同pH、多次凍融后仍能檢測到，并且含量變化不大［7］，而此時大多數RNA都會降解。這就為血清miRNA作為生物標志物進行檢測提供了可能。對于發(fā)現新的miRNA分子，克隆測序仍是首選方法［11，12］。RNA 印跡雜交，主要包括Northern雜交和原位雜交，是驗證和確認miRNA的重要方法，但該方法繁瑣并且靈敏度較低，不適用于臨床樣本的高通量檢測［13］。芯片技術檢測方法可以實現快速、高通量檢測［14］。目前已有多種類型的miRNA檢測芯片可以選用。但是，基因芯片檢測方法的重現性和準確性比較差，過去一般多用于初篩，現在已經發(fā)展到第二代基因芯片技術，即Solexa測序，研究人員可通過其大量的平行測序，發(fā)掘、鑒定并定量出任何物種全基因組水平的miRNA圖譜。應用這種低成本快速測定數百萬標簽序列的新方法，對獲得的結果通常需要采用RT-PCR進行驗證［7，15］。RT-PCR方法是基于PCR原理的檢測方法，主要包括基于莖-環(huán)的RT-PCR方法(stem-loop RT-PCR)、基于polyA 加尾的 RT-PCR 方法［16，17］和實時定量或非半定量RT-PCR。使用RT-PCR方法檢測血清miRNA所獲得純度高，方法也較為簡便，是現在測定血清miRNA的常用方法。

3 血清miRNA在疾病診治中的應用

3．1 血清內miRNA與腫瘤 腫瘤領域是血清miRNA研究最早、涉及病種最多的研究領域，涉及的腫瘤包括全身各個系統(tǒng)。一種miRNA可以調控多個下游的數百個基因，因此，通過miRNA獲得的信息比蛋白編碼基因更能對癌癥的亞型進行分類［18，19］。通過分析腫瘤患者與正常對照者血清miRNA表達的差異，有可能篩選到特異性好、靈敏度高、可作為特定腫瘤分子標志物的miRNA。在某些腫瘤患者血清中上調表達的miRNA，在另一些腫瘤中可能表達下調，提示血清miRNA在不同條件下可行使癌基因或抑癌基因的功能。Mitchell等［20］的研究證明，轉移性前列腺癌患者血清中miR-141含量是健康男性對照組的46倍，可成為檢測前列腺癌的血清miRNA標志物。Resnick等［10］通過研究患有卵巢癌婦女與正常婦女血清中的miRNA和CA125發(fā)現，miR-21、miR-92、miR-93在患者組的表達水平明顯增高，患者組中有3例未經手術的患者CA125正常，但其 miR-21、miR-92、miR-93仍然顯著增高。Hu等［15］最新研究發(fā)現，非小細胞肺癌長期生存患者與短期生存患者血清miRNA表達差異。用Solexa法選取在兩組患者血清中都表達的且表達差異＞5倍的11種miRNA進行樣本血清qRT-PCR驗證，最后得到5種具有顯著差異的 miRNA，其中 miR-486、miR-30d、miR-1、miR-499可作為非小細胞肺癌的生存預期的生物標志物。

3．2 血清內miRNA與肝病 肝臟中含有大量的miRNA-122，Bihrer等［21］從患有慢性丙型肝炎的患者和正常人中分別抽取血清進行miR-122檢查，同時對患者組進行肝功能組織學檢查，結果發(fā)現慢性丙型肝炎患者血清中miR-122水平明顯高于正常對照組，并且miR-122水平與肝臟炎癥程度指標具有相關性，miR-122與肝臟的谷丙轉氨酶水平和肝臟壞死性的炎癥強度相關，但與肝功能和肝纖維化程度無明顯相關性。因此，血清miR-122可作為慢性丙型肝炎壞死性炎癥的生物標志物。還有研究小組研究了乙型肝炎患者以及乙肝病毒陽性的肝癌患者血清中 miRNA，Li等［22］選取正常對照組 210 例，乙型肝炎患者135例，丙型肝炎患者48例，乙型肝炎病毒陽性的肝癌患者120例。取乙型肝炎患者與乙型肝炎病毒陽性肝癌患者血清miRNA分別與對照組使用Solexa測序及qRT-PCR驗證，結果分別發(fā)現13個和3個有明顯差異的 miRNA，這 13個血清 miRNA(miR-375、miR-92a、miR-10a、miR-223、miR-423、miR-23b、miR-23a、miR-342-3p、miR-99a、miR-122a、miR-125b、miR-150、let-7c)可以作為乙型肝炎的生物標志物，3種可以作為乙型肝炎病毒陽性肝癌標志物的 miRNA(miR-375、miR-25 和 let-7f)。

3．3 血清內miRNA與系統(tǒng)性紅斑狼瘡 之前已經有較多文獻報道組織miRNA與免疫系統(tǒng)疾病相關。Wang等［23］研究了系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者與正常對照組的血清miRNA發(fā)現，miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-429、miR-205 和 miR-192 在患者血清中表達水平明顯低于正常對照組，其中后5個與腎小球濾過率相關，miR-200a、miR-200c與蛋白尿呈負相關，系統(tǒng)性紅斑狼瘡病情程度與miR-200a呈負相關，血清miR-200b、miR-192與血小板計數相關，miR-205與紅細胞計數和血細胞比容相關。

3．4 血清內miRNA與其他疾病 血清中miRNA作為生物標志的研究不僅局限于以上領域，也在其他疾病的診治應用中取得了進展。Kong等［24］發(fā)現，在新診斷的2型糖尿病患者中，有7種血清miRNA水平明顯增高，即 miR-9、miR-29a、miR-30d，miR-34a、miR-124a、miR-146a 和 miR-375。Gilad 等［8］選取10個妊娠早期的母體血清和10個妊娠末3個月的母體血清，以及10個年齡與前兩組相匹配的非懷孕女性血清，檢測血清中包括胎盤特異性miRNA［25］在內的28種 miRNA的表達水平，發(fā)現懷孕婦女與未懷孕婦女的血清miRNA水平明顯不相同。所有胎盤miRNA在孕期血清中高表達，表達水平隨妊娠周數增加而升高，其中有12個miRNA增加超過了5倍。并且發(fā)現miR-526a、miR-527在妊娠末期明顯增加(超過 600倍)。胎盤中 miR-526a、miR-527和miR-520d-5P的表達水平可準確用于診斷是否妊娠。

4 展望

血清miRNA研究已經成為世界生命技術領域的研究熱點，并且這種趨勢還會延續(xù)下去。隨著對miRNA作用機制的進一步研究，將會使人們對高等真核生物基因表達調控的網絡理解提高到一個新的水平。而與此同時，通過利用各種最新的技術手段對血清miRNA和疾病間的關系進行研究也將使miRNA可能成為疾病診治的新的生物學標志物，還可能使得這一分子成為藥靶，或是模擬這一分子進行新藥研發(fā)，這可能會給人類疾病的治療提供一種新的手段。目前對于miRNA的了解還處于初始水平，只有很小部分miRNA生物學功能得到闡明，而對于絕大多數的miRNA的生物學機制和功能知之甚少，這些都是需要進一步研究和探索的。

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