禹亞彬，儲(chǔ) 建，章世海（綜述），卞建民（審校）

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京市第一醫(yī)院普外科，南京 210000）

1型糖尿病和全胰切除術(shù)后的患者體內(nèi)胰島素絕對(duì)缺乏。通過(guò)把有功能的胰島β細(xì)胞移植入體內(nèi)來(lái)治療胰島素絕對(duì)缺乏最近幾年來(lái)引起了廣大研究者濃厚的興趣，然而胰島移植面臨著供體有限、免疫排斥等問(wèn)題。已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)證明了通過(guò)誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞以及胰腺、肝臟、小腸上皮中的干細(xì)胞可以較容易地獲取產(chǎn)胰島素細(xì)胞，但是所獲取的細(xì)胞不能隨著葡萄糖濃度的波動(dòng)產(chǎn)生動(dòng)態(tài)反應(yīng)，免疫排斥，以及腫瘤形成這些問(wèn)題仍然存在。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）與組織干細(xì)胞以及胚胎干細(xì)胞相比具有相當(dāng)大的優(yōu)勢(shì)。MSC分化潛能巨大，不會(huì)引起免疫反應(yīng)，體外可以培養(yǎng)擴(kuò)增超過(guò)60代［1］，移植后組織學(xué)觀察也未發(fā)現(xiàn)腫瘤形成。因此，把MSC作為胰島β細(xì)胞的來(lái)源具有極大的應(yīng)用前景。從骨髓、臍帶等組織中分離而來(lái)的MSC要想成功地分化為胰島β細(xì)胞尚要考慮以下這些因素。

1 細(xì)胞間接觸對(duì)MSC分化為胰島β細(xì)胞的影響

在體外，MSC分化為成熟的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞與三維空間的形成密切相關(guān)?？赡艿脑蚴羌?xì)胞簇通過(guò)與鄰近的細(xì)胞更多的接觸來(lái)加快分化進(jìn)程、促進(jìn)受誘導(dǎo)細(xì)胞的成熟。細(xì)胞外基質(zhì)凝膠擁有豐富的膠原和層粘連蛋白，為三維結(jié)構(gòu)的形成提供了基礎(chǔ)。Gao等［2］的研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞外基質(zhì)凝膠上培養(yǎng)的由臍帶血間充質(zhì)細(xì)胞（umbilical cord blood mesenchymal stem cell，UCB-MSC）分化來(lái)的細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上更像β細(xì)胞。當(dāng)UCB-MSC在缺乏ECM gel培養(yǎng)的條件下被誘導(dǎo)時(shí)，它的分化停留在很早的階段，在培養(yǎng)15 d后看不到胰島樣的細(xì)胞簇，也檢測(cè)不到功能性蛋白的分泌。

Huang等［3］的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用不用胎牛血清包被的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)對(duì)UCB-MSC分化影響差別顯著。這可能是由于胎牛血清中像纖連蛋白、胎球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白這樣的蛋白加速了細(xì)胞間黏附，另外，轉(zhuǎn)鐵蛋白和鐵結(jié)合還降低了細(xì)胞毒性。

2 高糖培養(yǎng)基對(duì)MSC分化為胰島β細(xì)胞的影響

一般認(rèn)為低糖培養(yǎng)液可以很好地促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，而高糖培養(yǎng)基則不能。高糖培養(yǎng)基的影響可能是通過(guò)三個(gè)途徑:①破壞細(xì)胞膜的穩(wěn)定性;②影響細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境;③改變細(xì)胞內(nèi)外滲透壓。但是，高濃度的糖卻被認(rèn)為是MSC分化為胰島樣細(xì)胞強(qiáng)有力的誘導(dǎo)劑［4］。高濃度葡萄糖不僅可以增強(qiáng)胰島β細(xì)胞胰島素基因的表達(dá)，還可以刺激干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化［5］。因此對(duì)于MSC而言，在合適的時(shí)間添加高糖培養(yǎng)基來(lái)誘導(dǎo)其向胰島β細(xì)胞分化極其重要。

3 培養(yǎng)基pH對(duì)MSC分化為胰島β細(xì)胞的影響

高糖培養(yǎng)基H-DMEM容易變堿，而IMDM緩沖能力強(qiáng)，基本保持偏酸性。由于MSC一直生活在偏酸性的DMEM/F12培養(yǎng)基中，所以將其逐漸過(guò)渡到與之性質(zhì)相似的IMDM中，既有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)，又提供了細(xì)胞分化的必要條件［6］。

4 在培養(yǎng)基中添加某些化學(xué)試劑可以促進(jìn)MSC分化為胰島β細(xì)胞

一般認(rèn)為，尼克酰胺可以通過(guò)抑制ADP核糖體多聚酶活性來(lái)保持胰島細(xì)胞的活力和功能。Chen等［7］實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)單獨(dú)的高糖并不能使MSC分化為胰島樣細(xì)胞，但添加尼克酰胺后MSC則易轉(zhuǎn)化為胰島樣細(xì)胞。這意味著尼克酰胺可能是有效的誘導(dǎo)劑，它能保護(hù)分化的細(xì)胞死亡或者轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌愋偷募?xì)胞。神經(jīng)元細(xì)胞和胰島內(nèi)分泌細(xì)胞在起源上鄰近，都來(lái)自于內(nèi)胚層。神經(jīng)細(xì)胞可能是干細(xì)胞分化為胰島分泌細(xì)胞的過(guò)渡狀態(tài)［8］。神經(jīng)細(xì)胞特異性表達(dá)巢蛋白，已有一部分學(xué)者先將干細(xì)胞培養(yǎng)分化為巢蛋白陽(yáng)性細(xì)胞，然后再將其誘導(dǎo)為胰島β細(xì)胞［9，10］。β巰基乙醇通常被認(rèn)為是神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)劑。Chen等［7］添加β巰基乙醇增加了試驗(yàn)中尼克酰胺的效能。

另外，尚有學(xué)者在培養(yǎng)基中添加銀杏提取液，主要是通過(guò)增強(qiáng)受誘導(dǎo)細(xì)胞在高糖環(huán)境中的抗凋亡作用來(lái)促進(jìn)其向胰島β細(xì)胞分化［11］。

5 細(xì)胞因子在MSC分化為胰島β細(xì)胞中的作用

堿性成纖維生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的一種，其靶細(xì)胞主要分布于中胚層與神經(jīng)外胚層，但也能促進(jìn)內(nèi)胚層衍生物的有絲分裂。已知bFGF在很多報(bào)道中都作為胰島素分泌細(xì)胞的誘導(dǎo)劑使用，但其作用機(jī)制尚不明確。bFGF本身沒(méi)有信號(hào)肽，不能外分泌，通常在細(xì)胞死亡、細(xì)胞膜受到理化損傷時(shí)才被釋放到胞外［12］，或許在高糖培養(yǎng)基中添加bFGF可以模擬一種損傷的內(nèi)環(huán)境來(lái)促使細(xì)胞增殖和分化。表皮生長(zhǎng)因子是一種多功能的生長(zhǎng)因子，在體內(nèi)、體外都對(duì)多種組織細(xì)胞有強(qiáng)烈的促分裂作用。王越春等［6］發(fā)現(xiàn)，僅使用常規(guī)濃度的表皮生長(zhǎng)因子和bFGF作為誘導(dǎo)分化劑，就可以使臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord mesenchymal stem cell，UC-MSC）在高糖培養(yǎng)基中較快地發(fā)生形態(tài)學(xué)變化，并且在細(xì)胞內(nèi)和血清中都可以檢測(cè)到較高濃度的胰島素。雖然誘導(dǎo)而來(lái)的產(chǎn)胰島素細(xì)胞功能還不夠成熟，難以分泌足夠的胰島素，但此法初步顯示了其簡(jiǎn)便、快速、高效和安全的特點(diǎn)。

乙胞素屬表皮生長(zhǎng)因子家族，它在調(diào)節(jié)胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞前體的增殖和分化方面起著重要的作用［13］。有研究表明，乙胞素可促進(jìn)β細(xì)胞前體的增殖及向β細(xì)胞分化［14］，而且乙胞素可以通過(guò)上調(diào)Pax4的表達(dá)來(lái)促進(jìn)胰腺/胰島細(xì)胞的增殖、分化［15］。

另外，活化素A是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族的一個(gè)成員，它能調(diào)節(jié)體內(nèi) β細(xì)胞的再生［13，16］。胰高血糖素樣肽及其類似物Extendin4，被認(rèn)為具有刺激β細(xì)胞復(fù)制和導(dǎo)管細(xì)胞再生的能力［2］。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α能誘導(dǎo)β細(xì)胞增殖但不能誘導(dǎo)其分化;胰島素樣生長(zhǎng)因子能促進(jìn)導(dǎo)管細(xì)胞分化和胰島細(xì)胞增殖。

6 利用轉(zhuǎn)基因方法可以促進(jìn)MSC分化為胰島β細(xì)胞

PDX1、BTC基因在MSC分化為胰島β細(xì)胞中起著重要的作用。PDX1可以調(diào)節(jié)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BM-MSC）分化為產(chǎn)胰島素細(xì)胞，Yuan等［17］通過(guò)胰島素釋放試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)PDX1 cDNA轉(zhuǎn)染的MSC受到葡萄糖刺激后胰島素的分泌，通過(guò)雙硫腙染色可以看到胰島樣的結(jié)構(gòu)被染成黑紅色，而PDX-1表達(dá)陰性的細(xì)胞受葡萄糖刺激后沒(méi)有胰島素的分泌，雙硫腙染色也看不到胰島樣的結(jié)構(gòu)。Li等［18］的研究中MSC被攜帶大鼠PDX1和BTC基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示PDX-1與BTC同時(shí)表達(dá)顯著增加了MSC分化為巢陽(yáng)性上皮樣前驅(qū)細(xì)胞和胰島樣球狀體的能力。同時(shí)表達(dá)PDX-1和BTC的MSC胰島素和GLUT-2 mRNA的表達(dá)顯著上升，并且可以在葡萄糖刺激后分泌胰島素和C肽。轉(zhuǎn)基因BTC比直接添加BTC要好，因?yàn)樗芴岣呒?xì)胞與細(xì)胞之間的接觸。

Notch基因在MSC分化為胰島β細(xì)胞過(guò)程中亦發(fā)揮重要的作用。Hu等［19］的實(shí)驗(yàn)中UCB-MSC被轉(zhuǎn)染表達(dá)Notch受體和配體的基因。與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在分化過(guò)程中Notch信號(hào)的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致了胰島素基因、胰島素原、胰島素陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的下調(diào)。還有其他一些研究表明，Notch信號(hào)控制著胰腺的分化［20，21］，這些研究指出MSC分化為產(chǎn)胰島素細(xì)胞受Notch信號(hào)顯著影響，然而并不知道這些細(xì)胞是否表達(dá)Notch信號(hào)組分以及分化的具體機(jī)制。

7 結(jié)語(yǔ)

臨床上全胰移植以及胰島移植的成功證實(shí)了胰島β細(xì)胞替代療法的可行性，這使得1型糖尿病和全胰切除后的患者可以不再使用外源性胰島素［22］。MSC不存在倫理學(xué)問(wèn)題，并且具有免疫調(diào)節(jié)優(yōu)勢(shì)，因此把MSC作為胰島β細(xì)胞的再生源具有較好的應(yīng)用前景。影響MSC體外分化為胰島β細(xì)胞的因素錯(cuò)綜復(fù)雜，但可以肯定的是細(xì)胞外微環(huán)境和內(nèi)在的基因決定著MSC的命運(yùn)。雖然MSC經(jīng)誘導(dǎo)后可表達(dá)胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的標(biāo)記并能分泌胰島素，但對(duì)其分化機(jī)制尚未完全清楚，目前還不存在所謂的標(biāo)準(zhǔn)及完善的誘導(dǎo)方案，對(duì)誘導(dǎo)劑的使用劑量、濃度、使用時(shí)間、作用時(shí)間還需要進(jìn)一步探索?，F(xiàn)在眾多研究培養(yǎng)出的胰島β細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)尚不能很好地根據(jù)血糖的動(dòng)態(tài)變化來(lái)發(fā)揮功能，正如使用外源性胰島素并不能模擬生理性胰島素的分泌。因此，還需更多地對(duì)體外影響MSC向胰島β細(xì)胞分化的因素進(jìn)行研究，盡可能地模擬體內(nèi)β細(xì)胞成熟的環(huán)境來(lái)獲得擁有完整功能的β細(xì)胞。

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