王永志(綜述)，李 麗(審校)

(首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院中醫(yī)科，北京100050)

神經(jīng)形態(tài)知識的逐步深入，有賴于研究方法的不斷發(fā)展與改進，建立在中樞神經(jīng)系統(tǒng)上的銀染法、免疫組化法和神經(jīng)順行示蹤法等，同樣適用于針對感覺神經(jīng)末梢(sensory nerve ending，SNE)的研究。這樣，在SNE形態(tài)學基礎上，研究者可以對軀體神經(jīng)干、神經(jīng)分支在其走行過程中，由于某些原因受到慢性損傷引起的局部疼痛、壓痛、感覺異常等系列神經(jīng)功能障礙進行闡釋。

1 SNE分類

神經(jīng)末梢一般是指周圍神經(jīng)纖維軸突的終末，它分布于全身各種組織和器官中。神經(jīng)末梢包括接受體表和內(nèi)臟感覺傳入的SNE以及支配肌肉或腺體等效應器官的運動神經(jīng)末梢。臨床上各種感覺的產(chǎn)生均來自于SNE，其形態(tài)結構不同，種類甚多，根據(jù)形態(tài)學觀點可將其歸結為游離的神經(jīng)末稍和有被囊的神經(jīng)末稍兩種［1］。

1.1 游離神經(jīng)末稍 構成游離神經(jīng)末稍的多是Aδ類及c類神經(jīng)纖維。真皮內(nèi)的神經(jīng)纖維于不同深度反復分支，并失去髓鞘，形成裸露的軸突末稍，分布在表皮細胞之間，幾乎抵達角質(zhì)層。每個末稍分布于表皮1至數(shù)毫米范圍，彼此重疊交錯，使皮膚具有很高的敏感性。筋膜、韌帶、骨膜、腦膜、肌鍵、關節(jié)囊等處也有游離神經(jīng)末稍，一般認為它們大都是傷害感受器，各種不同性質(zhì)的刺激達到一定強度，就成為傷害性刺激，都能引起痛覺。目前研究認為，這種與傷害刺激有關的游離神經(jīng)末稍即是痛覺感受器。痛覺感受器在很多情況下是一種化學感受器，當組織受到損傷時，感受器周圍微環(huán)境的化學性質(zhì)發(fā)生改變，例如，損傷組織釋放出組胺、5-羥色胺、緩激肽、前列腺素和鉀離子等各種致痛物質(zhì)，作用于游離神經(jīng)末稍，達到傷害性刺激的程度，從而引起傳入沖動，進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起痛覺。

1.2 有被囊神經(jīng)末稍 此類神經(jīng)末梢包以結締組織成分組成被囊，種類很多，大小不一。它們大都有快適應的特點。目前研究比較多的有環(huán)層小體、觸覺小體、Ruffini小體和肌梭等。環(huán)層小體感受壓覺和震動覺，觸覺小體感受觸覺，Ruffini小體是一種機械感受器，而肌梭的功能則主要和肌肉活動相關。目前尚未發(fā)現(xiàn)這些感受器和疼痛有直接關系。

2 SNE形態(tài)學研究方法

在神經(jīng)解剖學研究中，1903年西班牙人建了Cajal法［1］，首次顯示了神經(jīng)元內(nèi)的神經(jīng)原纖維及軸突末梢，并因此榮獲諾貝爾獎。至20世紀末，各種研究方法層出不窮，神經(jīng)末梢的研究作為分支之一，同樣適合用這些方法進行形態(tài)學的觀察。

2.1 Cajal法 1903 年的 Cajal法［1］，首次顯示末梢與其他神經(jīng)元胞體間的連結不是連續(xù)的，而是接觸的，并由此建立了神經(jīng)元學說，即神經(jīng)元既是一個形態(tài)單位，又是一個功能單位。這個學說奠定了現(xiàn)代科學對神經(jīng)系統(tǒng)研究的基礎。以后各改良方法相繼出現(xiàn)，Cajal吡啶銀染色法顯示神經(jīng)原纖維、神經(jīng)末梢及外周神經(jīng)的再生過程效果良好，但也存在一定的不足［2］，如對標本的選擇要求非常嚴格，手術切除離體后，立即取材，同時浸入吡啶液固定，否則神經(jīng)原纖維、神經(jīng)末梢及周圍游離神經(jīng)易于變性，影響其顯示。

2.2 潰變軸突與終末鍍銀法 1890年的Marchi法因其不能染軸突及其終末，潰變的時間有限，已被淘汰。1946年的Gless終末鍍銀法可發(fā)現(xiàn)終末前變性，是順行追蹤該核團的投射情況及終止區(qū)的獨到的方法，一直為神經(jīng)解剖學研究者所使用。該方法的主要缺點是在核團損傷時，針道損傷的纖維也可染出，干擾了研究結果。因此自辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)法出現(xiàn)以后，近年來此法很少被應用。目前在銀染法中改良Bielschowsk神經(jīng)末梢染色法較為理想，最大特點是在鏡下可控制其反應程度或效果。神經(jīng)組織的浸染，最細的末梢也能清晰顯示出，而結締組織著色很淡［3］。

2.3 放射自顯影法 放射自顯影神經(jīng)追蹤(autoradiographic nerve tracing，ARNT)法是20世紀60年代后期，Lasek等將放射自顯影術用于神經(jīng)元投射途徑的研究時建立的。自從1972年 Cowan等首先用ARNT法研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)的纖維聯(lián)系以來，該法在神經(jīng)科學界得到廣泛應用，逐漸成為追蹤神經(jīng)纖維聯(lián)系的主要技術之一。該法的問世，是神經(jīng)形態(tài)研究方面的又一創(chuàng)新。ARNT法基于軸漿運輸?shù)臋C制。神經(jīng)元的胞體都能合成蛋白質(zhì)，并通過軸漿來運輸，胞體在合成蛋白質(zhì)時，對氨基酸是有選擇性的攝取和運輸?shù)?。因此，用放射性核素標記的氨基酸，被胞體攝取合成蛋白質(zhì)后沿著軸漿的運輸路徑可通過顯影來進行觀察。該種方法比較靈敏，最大優(yōu)點就是不標記過路纖維，克服了HRP法和神經(jīng)纖維潰變法標記過路纖維的缺點。但注射范圍小，對廣泛起源的通路不適用，而且需要較長時間才能觀察結果，若有偽像與錯誤不能及時得以校正，費時又費力，近年來也少被應用。

2.4 順行示蹤法 HRP示蹤法［4］:1971年，Kristenson和Olsson首先報道HRP可被神經(jīng)末梢攝取，經(jīng)軸漿逆行運輸至神經(jīng)元胞體，然后用組織化學方法即可顯示出神經(jīng)元的輪廓，從而創(chuàng)建了HRP追蹤神經(jīng)元示蹤技術，即HRP法。HRP法的基礎是軸漿運輸，軸漿運輸是神經(jīng)元的一項基本活動，即沿其軸突有從胞體向末梢(順向)及從末梢向胞體(逆向)的物質(zhì)轉(zhuǎn)運。HRP法建立的早期，僅用于逆行追蹤，即將HRP注入神經(jīng)的末梢部位，經(jīng)逆行軸漿運輸至胞體，再通過酶組化染色顯示。以后的實驗證明，HRP也可用于順行運輸，即將HRP注入神經(jīng)元胞體所在部位，HRP可順向運送至末梢部位。此后，為提高HRP本身的靈敏度而有一些結合HRP的產(chǎn)生，如麥芽凝集素結合HRP、霍亂毒素B結合HRP、去霍亂毒素結合HRP、菜豆凝集素結合HRP等。HRP方法的問世，在神經(jīng)科學研究領域中極富價值，它結束了自Marchi(1886年)開始長達一個世紀的唯用銀染法追蹤潰變纖維的年代，在神經(jīng)束路追蹤的形態(tài)及功能研究中具有劃時代的意義。至今，HRP追蹤技術已可運用于逆行追蹤、順行追蹤和跨節(jié)轉(zhuǎn)運。HRP的缺點是在中樞注射區(qū)有向周圍擴散現(xiàn)象，可采用微量注射或微電泳導入技術加以克服。而其究竟能被末梢攝取的有效范圍有多大，至今尚無十分準確的判斷標準。

葡聚糖是由腸系膜明串珠菌產(chǎn)生的多聚體，分子量有大有小，用于示蹤的葡聚糖相對分子質(zhì)量一般為3×103。葡聚糖與不同的標志物結合形成各種追蹤劑。較常用的有四甲基羅達明葡聚糖胺和生物素葡聚糖胺(biotinylated-dextran amine，BDA)，兩者均可用于順行和逆行追蹤，但BDA的順行追蹤結果優(yōu)于逆行追蹤。BDA與卵白素之間有特別強的親和力，常用結合了過氧化物酶或熒光素的卵白素與之孵育結合，通過組化反應或熒光顯微鏡觀察顯示標記結果。葡聚糖追蹤法的優(yōu)點是:注射部位局限，動物存活時間較短，顯示反應程序簡單，靈敏度高，能進行多重順行追蹤標記。

2.5 熒光組織化學及免疫組織細胞化學法 1962年Falck-Hillarp發(fā)現(xiàn)了甲醛誘發(fā)熒光法，此法可使神經(jīng)元內(nèi)所含的單胺類物質(zhì)與醛聚合成新的環(huán)形化合物，在熒光顯微鏡下發(fā)射出波長不同的熒光。用熒光顯微鏡觀察，兒茶酚胺末梢和細胞呈綠色熒光。5-羥色胺神經(jīng)元及末梢呈黃色熒光。此法用甲醛蒸氣，需冷凍干燥裝置，比較麻煩。1972年瑞典學者Bjorklund和Lindvail創(chuàng)立乙醛酸誘發(fā)熒光法，手續(xù)簡便，也得到同樣效果。至今已有許多改良的技術，使該技術的敏感性和特異性大為提高。

20世紀70年代至今，免疫組織化學方法廣泛應用于神經(jīng)解剖學的研究，它利用制備的特異性抗體血清(或單、多克隆抗體)與神經(jīng)組織或細胞中相應的抗原結合。把相應的抗原諸如 PGP9.5［5，6］、降鈣素基因相關肽、P物質(zhì)［7］等作為標志物，顯示不同功能的神經(jīng)纖維陽性反應。此結合的顯示有直接法和間接法。直接法步驟簡便、特異性強、敏感性差。間接法顯示抗原抗體結合物的靈敏度高，一般用羊抗兔作為第二抗體與第一抗體上的抗原結合，或用熒光素與第二抗體結合，也可用靈敏度高的HRP或卵白素生物素過氧化物酶復合體與第二抗體結合，以顯示抗原抗體結合物在神經(jīng)細胞體或其神經(jīng)末梢的存在。

3 軀干四肢SNE形態(tài)學的研究

SNE廣泛分布于身體各個部位，本文僅對臨床上四肢和軀干易于發(fā)生軟組織疼痛的部位按解剖層次進行分述。

3.1 皮膚內(nèi) SNE 的研究 Cauna［8］應用 Bielscho wsky神經(jīng)末梢染色法于光、電鏡下研究人手指皮膚游離神經(jīng)末梢的精細形態(tài)，實驗未麻醉，于指部直接活檢取材。研究中見有大量形態(tài)不同的游離神經(jīng)末梢分布于指部，光鏡下計數(shù)換算后每1 mm2約有各形態(tài)軸突末梢250個。末梢多垂直于皮膚表面，每一末梢支配一定表面區(qū)域，與臨近末梢不重疊，這樣的結構具備更好的精細觸覺和兩點辨別覺。這一點明顯不同于有毛皮皮膚的神經(jīng)末梢分布。該方法的缺點是在材料的選擇上，對顯示游離神經(jīng)末梢的選材以人的口唇或小白鼠上唇為好，觸覺小體的選材以人指尖掌側為好，這使得此方法有一定局限性，同時本方法不適于大批標本的制作［9］。

Marfurt等［10］通過在SD大鼠三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)注射HRP追蹤其順行運輸分布部位，在24～48 h內(nèi)分別處死各組大鼠，常規(guī)組織取材，切片、四甲基聯(lián)苯胺顯色，光鏡下觀察。HRP可被運輸?shù)礁鱾€神經(jīng)末梢，在角膜、觸須毛囊、牙髓、牙周組織、面部皮膚均可見其蹤跡，在其軸突及末梢內(nèi)比較密集，能夠清楚地顯示標記結構的位置和形態(tài)。Marfurt認為，本法標記后比較容易將神經(jīng)纖維和末梢與其他組織區(qū)分，結果優(yōu)于銀染法，因在銀染法下，由于其他組織，例如，網(wǎng)狀纖維或彈性纖維的嗜銀性，使得神經(jīng)組織不易與之鑒別。在另一項研究再生神經(jīng)纖維的分布的實驗中［11］，研究者采用CB-HRP順行示蹤技術，驗證再生纖維的來源和分布。實驗中行部分椎板切除術，顯露神經(jīng)節(jié)，用玻璃顯微吸管將4 μL的2%CBHRP注入神經(jīng)節(jié)，動物存活96 h，以甲醛混合液進行心臟灌注。取下神經(jīng)節(jié)及移植皮瓣存于含10%蔗糖的磷酸緩沖液中12 h，冷凍切片，四甲基聯(lián)苯胺法進行呈色，光鏡下進行觀察。經(jīng)1、2、4、6個月觀察證實失神經(jīng)皮瓣獲得神經(jīng)再支配是依賴植入的神經(jīng)，而不是周圍皮膚內(nèi)神經(jīng)的長入。這種方法能區(qū)分粗大及纖細的神經(jīng)纖維，而且由于將CB-HRP注射于脊髓背根節(jié)，因此可以了解外周皮膚某一區(qū)域內(nèi)的神經(jīng)末梢分布情況。

3.2 筋膜SNE的研究 在胸腰筋膜神經(jīng)分布的研究中，Stilwell［12］發(fā)現(xiàn)，比較大的環(huán)層小體及類似環(huán)層小體的小團狀物和高爾基腱器官小體。而Hirsch等［13］僅觀察到精細的游離神經(jīng)纖維和一些沒有被囊的末梢復合體。鑒于當時實驗條件限制，這些研究主要應用的是硝酸銀浸染及亞甲基藍染色，沒有能夠特異地對神經(jīng)組織進行染色。

針對這種情況，Yahia等［14］在1992年應用免疫組織化學技術來研究胸腰筋膜神經(jīng)分布，通過對神經(jīng)絲蛋白及S100蛋白血清抗體免疫化學染色，對患者術后胸腰筋膜進行研究，光鏡下除發(fā)現(xiàn)游離神經(jīng)末梢外，同時觀察到兩種機械感受器(Ruffini末梢及環(huán)層小體)，研究中對神經(jīng)絲蛋白只觀察到陽性神經(jīng)束，未見其他末梢小體結構，而針對S100蛋白抗血清則觀察到Ruffini末梢及環(huán)層小體。說明兩種不同的方法適用于不同的感覺神經(jīng)組織結構。采用神經(jīng)組織化學方法［15］，通過乙醛酸誘發(fā)熒光法對家兔頸椎前軟組織內(nèi)腎上腺素能神經(jīng)、膽堿能神經(jīng)進行觀察。結果在椎前筋膜內(nèi)觀察到腎上腺素能纖維有廣泛的分布;乙酰膽堿酯酶陽性纖維少量散在于其間。從形態(tài)學上證明頸椎前軟組織內(nèi)存在大量的交感神經(jīng)末梢。另一項研究中［16］采用放射性核素示蹤技術，對注入家兔頸后交感神經(jīng)節(jié)的核素32P順行追蹤到頸椎前軟組織，觀察到交感神經(jīng)有分支分布到頸椎前縱韌帶和椎前筋膜。

3.3 肌肉SNE的研究 肌組織中除肌張力感受器外，75%骨骼肌的感覺神經(jīng)來自肌筋膜中的游離神經(jīng)末梢，走行于肌纖維和血管之間，屬于有髓的Aδ和無髓的C纖維，是肌傷害感受器。Marina［17］觀察到機體的肌肉傷害感受器屬機械感受性，閾值低于肌痛閾。在小鼠皮大肌降鈣素基因相關肽免疫反應(calcitonin gene-related peptide immunoreactive，CGRP-IR)神經(jīng)纖維分布的研究中［18］，針對小鼠皮膚進行整裝鋪片、石蠟切片、CGRP-IR卵白素-生物素-酶復合物染色法(ABC法)染色。光鏡下觀察，皮膚整裝鋪片上可見到真皮及皮大肌CGRP-IR神經(jīng)纖維網(wǎng)，皮大肌的CGRP-IR神經(jīng)纖維與肌纖維形成運動終板。應用Sihler染色法，觀察到家兔不同形態(tài)肌的肌內(nèi)神經(jīng)分支分布與肌纖維排列有關;肌內(nèi)神經(jīng)分支走行有與肌束平行和(或)垂直兩種形式［19］。Sihler染色法早年用于染肌梭，后經(jīng)改良，目前已成為研究骨骼肌肌內(nèi)神經(jīng)的重要方法。其優(yōu)點是在不損傷肌外形的情況下，清楚地顯示了原來肉眼不能見到的肌束與肌內(nèi)神經(jīng)分支的三維關系，為神經(jīng)肌肉移植、電生理研究等提供了可靠的形態(tài)學依據(jù)［20］。

4 結語

目前對臨床中常見的各種軀干、四肢軟組織疼痛的研究，大多集中在血生化及電生理學等方面，而在組織學上，疼痛的感覺終器主要由感覺神經(jīng)末稍引起，那么在病變后其形態(tài)學如何變化，目前在基礎研究中這一點備受關注。SNE形態(tài)的研究，大多建立在基本神經(jīng)形態(tài)學研究方法之上。在具體研究中根據(jù)研究課題的需要，可以幾種方法結合，如銀染法、雙重熒光素標記或標記后又進行免疫組化反應、HRP法與免疫組化法結合等，這樣既能了解神經(jīng)末梢分布情況，又可知道其細胞的化學性質(zhì)，為闡明某一病變提供形態(tài)學基礎。

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