汪 亮，劉潘潘，胡勤樂

(1．寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究生部，浙江寧波315211;2．浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究生部，杭州310058;3．寧波市第一醫(yī)院神經(jīng)外科，浙江寧波315010)

隨著人口的老齡化，腦血管疾病已經(jīng)成為世界上危害人類健康的三大疾病之一。我國(guó)每年新發(fā)腦卒中病例已超過200萬，其中缺血性腦卒中占80%以上，其致殘率和腦損傷程度均超過腦出血。而缺血性腦血管疾病中，尤以大腦中動(dòng)脈閉塞最為常見［1］。因此制備一種理想的大腦中動(dòng)脈腦缺血/再灌注模型(middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R)是研究缺血性腦血管病的前提條件。目前，制備MCAO/R模型的方法較多，其中線栓法致MCAO/R模型備為推崇。線栓法建立大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞缺血模型不需開顱，創(chuàng)傷小，不影響腦缺血后腦水腫和顱內(nèi)壓等病理變化，特別適合于局部損傷后腦功能改變及治療藥物評(píng)價(jià)等實(shí)驗(yàn)研究［2，3］。本研究在參考一些經(jīng)典線栓法的基礎(chǔ)上，對(duì)“腦缺血/再灌注損傷保護(hù)”進(jìn)行思考、探索，為研究局灶性腦缺血/再灌注損傷提供一種較為理想、可靠且操作較為簡(jiǎn)便的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制作方法。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性大鼠32只(體質(zhì)量250～280 g)，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。隨機(jī)分為2組，手術(shù)組和假手術(shù)組分別為20只和12只。

1．2 栓線準(zhǔn)備 市售3-0號(hào)魚線，直徑為0．256 mm。其制備方法:先浸入0．1%多聚賴氨酸溶液中，再放入50℃烤箱中干燥，取出后頭端涂以硅橡膠，然后懸掛陰干。

1．3 模型制備 大鼠經(jīng)10%水合氯醛(0．4 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，頸部皮膚備皮消毒，取頸部右側(cè)旁正中切口，鈍性分離皮下組織、右側(cè)胸鎖乳突肌及頸前部肌群，然后暴露并游離右側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery，CCA)約1 cm，并于近心端將之結(jié)扎，遠(yuǎn)心端(靠近CCA及分叉處)掛線以便于牽拉和向遠(yuǎn)端分離，并可在后續(xù)操作中防止栓線滑落和減少出血。操作中注意仔細(xì)分離迷走神經(jīng)，避免牽拉損傷迷走神經(jīng)而致呼吸驟停。找到CCA分叉后，繼續(xù)分離頸外動(dòng)脈(external carotid artery，ECA)將之結(jié)扎，牽拉ECA進(jìn)一步分離頸內(nèi)動(dòng)脈，并掛線向遠(yuǎn)端進(jìn)一步分離頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery，ICA)主干以便于調(diào)整插線方向與角度。用眼科剪于CCA結(jié)扎的遠(yuǎn)心端(距CCA分叉處約2 mm)斜行45°剪一小口并導(dǎo)入栓線，導(dǎo)入后單結(jié)稍打緊預(yù)留在CCA的掛線以減少出血，調(diào)整好插線方向及角度，栓線經(jīng)CCA順利進(jìn)入ICA，此時(shí)放松CCA單結(jié)，繼續(xù)將栓線往前推送，直至到達(dá)大腦中動(dòng)脈起始部，遇阻力停止，長(zhǎng)度18～20 mm。雙結(jié)打緊住栓線，確認(rèn)無出血后縫合皮膚，術(shù)后1．5 h后抽出線栓。假手術(shù)組只結(jié)扎CCA而不導(dǎo)入線栓。

1．4 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 大鼠缺血/再灌注24 h后，對(duì)其進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。參照經(jīng)典的Zea Longa法［4］:無神經(jīng)功能缺損癥狀為0分;輕微神經(jīng)功能缺損，不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪為1分;中度局灶性神經(jīng)功能缺損，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈為2分;重度局灶性神經(jīng)功能缺損，向?qū)?cè)傾倒為3分;不能自發(fā)行走且意識(shí)水平下降為4分。

1．5 氯化三苯四氮唑(tetrazolium chloride，TTC)染色 大鼠缺血/再灌注24 h后給予左心室磷酸鹽緩沖液灌注，然后斷頭取腦，取腦時(shí)發(fā)現(xiàn)有蛛網(wǎng)膜下腔出血者給予排除;取出鼠腦后置于－20℃冰箱中快速冰凍約15 min，然后冠狀位均勻切成2 mm厚度腦組織5～6片;將切好的腦片置于2%的TTC磷酸鹽緩沖液中，避光后給予37℃恒溫水箱孵育15～30 min，待完全顯色后置于4%多聚甲醛固定。

2 結(jié)果

2．1 大鼠神經(jīng)行為觀察 大鼠腦缺血/再灌注24 h后，手術(shù)組有15只大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分為1～2分，出現(xiàn)行走時(shí)左側(cè)肢體伸展不全，以前肢為重，有部分大鼠可出現(xiàn)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈，提起鼠尾時(shí)左側(cè)前肢無力屈曲，反抗力明顯減弱;1只大鼠在麻醉后手術(shù)過程中死亡;1只大鼠取腦時(shí)發(fā)現(xiàn)存在蛛網(wǎng)膜下腔出血;2只大鼠神經(jīng)功能缺損不明顯，評(píng)分為0～1分;1只大鼠術(shù)后神經(jīng)功能缺損評(píng)分可達(dá)3～4分，24 h后發(fā)現(xiàn)已死亡。模型成功率為75%。假手術(shù)組神經(jīng)行為則與正常小鼠無明顯差別。

2．2 TTC染色 存活大鼠24 h后取腦切片，手術(shù)組造模成功大鼠腦冠狀切面經(jīng)TTC法染色后，可見右側(cè)尾狀核及額頂皮質(zhì)不同程度的蒼白色梗死區(qū)。假手術(shù)組TTC染色后為正常紅色腦組織。

3 討論

3．1 動(dòng)物選擇 大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)腦血管變異較少，種系純性好，價(jià)廉易得，具有極強(qiáng)的抗感染能力，已成為目前最常用的局灶性腦缺血模型動(dòng)物材料。而在不同的大鼠品種之間，SD大鼠進(jìn)行MCAO/R建模后，梗死面積較大較固定且價(jià)廉易得，故采用SD種系大鼠為建立MCAO/R模型最常用大鼠。老齡大鼠大腦中動(dòng)脈已發(fā)生不同程度的動(dòng)脈扭曲或官腔狹窄，使得線栓難以推進(jìn)，故在目前實(shí)驗(yàn)操作中，仍以青壯年雄性大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象［5］。

3．2 麻醉劑的選擇 制作MCAO/R模型可有多種麻醉劑選擇，國(guó)外制作該模型目前多采用氟烷誘導(dǎo)麻醉，繼以將氧化亞氮與純氧按比例混合后，行機(jī)械通氣維持吸入麻醉，但價(jià)格昂貴，步驟繁瑣。而國(guó)內(nèi)學(xué)者多用10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射，國(guó)內(nèi)張彥等［6］認(rèn)為，采用10%水合氯醛作為制作MCAO/R模型的麻醉劑效果較好。

3．3 線栓選擇及處理 辛世萌等［7］曾通過大量研究實(shí)驗(yàn)，提出線栓直徑及插入的長(zhǎng)度應(yīng)與大鼠體質(zhì)量呈正比，大鼠體質(zhì)量250～330 g，插入線長(zhǎng)17 mm或18 mm，栓線直徑0．28 mm為最佳匹配方案，制作的MCAO/R模型成功率高、重復(fù)性好、生理指標(biāo)影響小，適合用于探討腦缺血/再灌注機(jī)制及評(píng)價(jià)藥物療效。最近鄭建明等［8］通過研究指出，使用直徑為0．28 mm和頭端直徑為0．32～0．34 mm的栓線能較為顯著地提高模型的穩(wěn)定性。國(guó)外文獻(xiàn)已有報(bào)道，相同號(hào)碼線栓對(duì)不同體質(zhì)量大鼠造模效果不一致［9］。本研究采用250～300 g大鼠，線栓進(jìn)入長(zhǎng)度18 mm左右，結(jié)果20只中僅有1只出現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血，考慮原因是栓線穿破顱底動(dòng)脈，或是栓線與顱底動(dòng)脈產(chǎn)生粘連，在拔栓線時(shí)將顱底動(dòng)脈撕破所致。另外2只神經(jīng)功能評(píng)分為0～1分，TTC染色為較小范圍梗死灶，考慮為栓線插入過短從而未導(dǎo)致完全性大腦中動(dòng)脈閉塞。國(guó)外學(xué)者Durukan等［10］也指出這種模型存在一些缺點(diǎn):①易出現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血，病死率較高;②常出現(xiàn)不能完全閉塞大腦中動(dòng)脈的現(xiàn)象。栓線頭部的正確處理已經(jīng)公認(rèn)成為影響制備大鼠MCAO/R模型的重要因素，有學(xué)者曾提出可將栓線頭端燙成光滑的圓球。Ma等［11］將更細(xì)直徑的6-0單股尼龍線表面涂以硅樹脂制備的栓線，經(jīng)ICA超選擇性進(jìn)入大鼠的大腦中動(dòng)脈。而本研究采用的栓線頭端覆以左旋多聚氨酸，從而使線栓與血管壁的黏附性增加，彌補(bǔ)了大鼠體重及血管大小的個(gè)體差異所致的線栓表面與血管壁間的微小間隙，從而完全阻斷血流，可以增加缺血穩(wěn)定性?？傊?，線栓端部如何處理還需要大量的實(shí)驗(yàn)研究，線栓端部處理是否合理已經(jīng)公認(rèn)為實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。

3．4 手術(shù)方式的選擇 線栓的插入傳統(tǒng)上有兩種方法:一種是采用從ICA或CCA插入線栓。另一種方法是采用頸外動(dòng)脈切口，插入后向下，輕按ECA使之與ICA成近似直線，順ECA走向在頸內(nèi)動(dòng)脈中緩慢推進(jìn)直至感覺有少許阻力為止。由于缺少經(jīng)驗(yàn)，本組采用了第一種線栓插入方法，即從CCA插入線栓，效果較為滿意。而王毅剛等［12］采用了距CCA分叉1 cm處的切口，不分離ECA和ICA，且不結(jié)扎ECA的手術(shù)方法，通過調(diào)整進(jìn)線角度使線栓從CCA順行進(jìn)入ICA，進(jìn)而入顱堵塞大腦中動(dòng)脈，取得良好效果。在模型制作過程中，遇到的最大困難是栓線插線時(shí)的大出血，以及有時(shí)栓線無法正確插入ICA，故除了用血管夾夾閉ECA、ICA外，可直接在ECA、ICA套上一根絲線牽拉，既有助于手術(shù)分離，又有助于控制出血。武強(qiáng)等［13］的模型做法是先以2個(gè)微動(dòng)脈分別夾閉CCA和ICA，然后切斷ECA，由斷端送入栓線至CCA分叉處，然后翻轉(zhuǎn)方向，松開夾閉ICA的微動(dòng)脈夾，將栓線向內(nèi)上方向角度緩慢在ICA內(nèi)推進(jìn)。若線栓誤入翼腭動(dòng)脈，則可先用微動(dòng)脈夾臨時(shí)夾閉。國(guó)內(nèi)孫宇等［14］學(xué)者指出，通過永久結(jié)扎大鼠頸總動(dòng)脈近心端，不游離翼腭動(dòng)脈，由頸總動(dòng)脈分叉處將線栓插入大腦中動(dòng)脈方法制備MCAO再灌注模型是可行的，能明顯減少造模的時(shí)間。而本組在操作上也未對(duì)大鼠的翼腭動(dòng)脈加以分離及處理，因?yàn)橐黼駝?dòng)脈位置深在，若結(jié)扎該動(dòng)脈，神經(jīng)肌肉損害嚴(yán)重，可能會(huì)引起進(jìn)食困難，給大鼠造成極大傷害，增加大鼠的死亡率。在手術(shù)操作過程中，保持室溫在25～30℃，在分離動(dòng)脈過程中，注意保護(hù)沿著ECA、CCA走行的迷走神經(jīng)，防止呼吸道分泌物過多。呼吸道分泌物過多時(shí)可適當(dāng)吸痰，術(shù)后注意保溫，這些措施可以提高動(dòng)物的生存率。

目前，MCAO/R模型在制備方法、實(shí)驗(yàn)條件的控制等方面都取得了很大進(jìn)展。轉(zhuǎn)基因大鼠的出現(xiàn)，超聲、介入等新技術(shù)的發(fā)展及其在模型制備中的應(yīng)用，也在很大程度上促進(jìn)了MCAO/R模型的研究。線栓制備MCAO/R模型的影響因素較多，最近國(guó)外有文獻(xiàn)指出大鼠的年齡和性別都嚴(yán)重影響著該模型的效果［15］，故應(yīng)該首先對(duì)整體的實(shí)驗(yàn)體系進(jìn)行全面評(píng)估和調(diào)整，盡可能優(yōu)化制備MCAO/R模型的實(shí)驗(yàn)條件，從而制備出可靠、穩(wěn)定、重復(fù)性好、成功率高的理想的MCAO/R模型，為腦缺血病理生理的研究和治療藥物的研制發(fā)揮更加科學(xué)有效的作用。

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