何開(kāi)勇，周素文，高華

(1.湖北省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，武漢 430064;2.中國(guó)食品藥品檢定研究所，北京 100050)

非腸道給藥臨床使用已有100多年，關(guān)于藥物熱原的問(wèn)題已經(jīng)明確，無(wú)熱原是非腸道給藥的必備條件。家兔熱原檢查法能檢查出各種熱原，但不能定量和標(biāo)準(zhǔn)化，重復(fù)性比較差。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法(bactaril endutoxin test，BET)具有經(jīng)濟(jì)、快速、簡(jiǎn)便、可定量、標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，但只能檢查細(xì)菌內(nèi)毒素且受多種物質(zhì)的干擾。體外人全血熱原實(shí)驗(yàn)方法原理是基于人體發(fā)熱機(jī)制的一種體外試驗(yàn)方法，通過(guò)檢測(cè)內(nèi)熱原的含量可定量或定性反映樣品中所含各種熱原的質(zhì)量，具有體外高靈敏度和寬檢測(cè)譜的優(yōu)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào):981，效價(jià):每支9 000 EU);脂磷 壁 酸 (lipoteichoicacid，LTA，Sigma公 司，批 號(hào):085k4111);酵母多糖(Zymosan，Sigma公司，批號(hào):045k1010;人白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6 及腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factorα，TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked Immuno-sorbent assay，ELISA)試劑盒，深圳晶美生物有限公司提供，批號(hào):060525，061022，061206;定量鱟試劑，湛江安度斯生物有限公司，0710263;MCO-15AC型二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(SANYO);Wellscsn MK2型酶標(biāo)儀(Denley dragon);ZRY-2A智能熱原測(cè)定儀(天津大學(xué)無(wú)線電廠)。

1.2 方法

1.2.1 家兔熱原檢查法 挑選合格家兔隨機(jī)分成15組，測(cè)量兔的正常體溫，各組分別注射內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 品 (濃 度 分 別 為 2.0，1.0，0.5，0.25，0.125 EU·mL-1)，LTA(濃度分別為 2，1.0，0.5，0.25，0.125 μg·mL-1)，Zymosan(濃度分別為 64，32，16，8，4μg·mL-1)，注射體積均為10.0 mL·kg-1。注射后每15 min測(cè)量1次家兔體溫，共檢測(cè)300 min，以時(shí)間對(duì)體溫升高值作圖。樣品檢測(cè)按《中華人民共和國(guó)藥典》2010 年版［1］進(jìn)行。

1.2.2 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法(BET) 按《中華人民共和國(guó)藥典》2010 年版［1］進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 體外人全血熱原實(shí)驗(yàn)方法

1.2.3.1 方法研究 健康獻(xiàn)血者至少1周沒(méi)有受病毒和細(xì)菌感染的，未服用對(duì)細(xì)胞因子產(chǎn)生影響的藥物，全血以10 U·mL-1肝素鈉抗凝。試驗(yàn)采用無(wú)菌無(wú)熱原24孔組織培養(yǎng)板為載體，于每孔加氯化鈉注射液1 000μL、細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品或空白對(duì)照品100μL、全血100μL［2］，細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品序列濃度為0.25，0.5，1.0 EU·mL-1，空白對(duì)照品為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，每一細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品或空白對(duì)照品平行重復(fù)3孔，加畢振蕩混勻立即置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，分別于 2，4，6，16，20，24 h 末取樣離心，取上清液100μL用ELISA 方法檢測(cè) IL-1β、IL-6及 TNF-α 的含量，以時(shí)間對(duì)吸光度值作圖。

1.2.3.2 樣品檢測(cè) 檢測(cè)按WBT-IL-1β法進(jìn)行，設(shè)計(jì)回收試驗(yàn)組和供試品組，每組重復(fù)3孔?；厥赵囼?yàn)組溶液制備:在供試品溶液中添加0.5 EU·mL-1的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，本次全血IL-1β的釋放量與LPS序列濃度的線性關(guān)系為CIL-1β=884.54CLPS-0.51，r=0.996，線性范圍0.03～0.5 EU·mL-1，通過(guò)樣品稀釋液及其回收試驗(yàn)刺激全血釋放的IL-1β濃度平均值分別計(jì)算相當(dāng)LPS濃度，并根據(jù)相當(dāng)LPS濃度計(jì)算回收率，計(jì)算公式如下:回收率(%)=(回收試驗(yàn)組LPS濃度-供試品組平均LPS濃度)/0.5×100%。參照《中華人民共和國(guó)藥典》［1］，回收率在50% ～200%范圍內(nèi)認(rèn)為樣品對(duì)系統(tǒng)無(wú)干擾，實(shí)驗(yàn)有效?；厥章嗜舨环弦?，則繼續(xù)稀釋2，4，8，16 倍后試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 家兔對(duì)LPS、LTA及Zymosan的熱原反應(yīng) 結(jié)果見(jiàn)圖 1～3。家兔最大允許注射體積為10.0 mL·kg-1［1］，以此推斷家兔對(duì)內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品、LTA、Zymosan 3種熱原質(zhì)的最低檢測(cè)濃度分別為0.5 EU·mL-1，0.5 μg·mL-1，16 μg·mL-1，LPS 致熱活性最強(qiáng)，LTA次之，Zymosan最弱。與文獻(xiàn)［3］報(bào)道一致。LPS、LTA及Zymosan使家兔發(fā)熱最高點(diǎn)分別在注射后90～105，120～135，195～210 min之間，依次延長(zhǎng)。而現(xiàn)行家兔熱原檢查法檢測(cè)時(shí)間僅為180 min［1］，藥物如被Zymosan污染，現(xiàn)行家兔熱原檢查法不能有效檢測(cè)。LTA及Zymosan使家兔發(fā)熱至最高點(diǎn)后體溫下降速度比LPS慢，體溫升高狀態(tài)持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。

2.2 孵育時(shí)間對(duì)LPS濃度 梯度刺激全血釋放IL-1β、IL-6及TNF-α的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4～6。各LPS梯度刺激IL-1β及IL-6分泌量在4 h最大，繼續(xù)孵育，分泌量較穩(wěn)定，認(rèn)為系統(tǒng)孵育時(shí)間4～24 h均可，國(guó)際合作確認(rèn)組織推薦10～24 h［2］，考慮到對(duì)弱熱原質(zhì)需要更長(zhǎng)時(shí)間，為使反應(yīng)充分及取樣時(shí)間的安排孵育時(shí)間定為20 h。0，0.25，0.5 EU·mL-1LPS梯度刺激IL-1β及IL-6分泌量在孵育4 h后有明顯差別，熱原質(zhì)刺激人全血釋放的IL-1β分泌量明顯高于IL-6分泌量。但1.0 EU·mL-1刺激的分泌量對(duì)于0.5 EU·mL-1增加不大明顯，說(shuō)明0.5 EU·mL-1刺激的分泌量已接近平臺(tái)期，且斜率在 0～0.5 EU·mL-1內(nèi)最大。0.25 EU·mL-1組和0 EU·mL-1組分泌的TNF-α差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明0.25 EU·mL-1的LPS不能刺激系統(tǒng)釋放TNF-α，系統(tǒng)靈敏度低。0.5，1.0 EU·mL-1雖然能刺激系統(tǒng)產(chǎn)生TNF-α，但4 h達(dá)到最高點(diǎn)后持續(xù)下降，說(shuō)明LPS刺激系統(tǒng)釋放TNF-α不太穩(wěn)定，孵育時(shí)間對(duì)TNF-α釋放影響較大，系統(tǒng)耐用性不好，與人體試驗(yàn)結(jié)果相一致［4］，人全血體外熱原試驗(yàn)與人體對(duì)LPS的反應(yīng)存在一致性。

2.3 3種 熱原試驗(yàn)方法比較 對(duì)幾種樣品的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。甘油果糖注射液最初家兔熱原檢查為不合格，用人全血-IL-1β法檢測(cè)為合格的邊緣產(chǎn)品，考慮到家兔對(duì)熱原質(zhì)個(gè)體差異，故選取5只家兔按家兔熱原檢查復(fù)試的要求復(fù)檢，結(jié)果僅一只家兔體溫升高0.6℃，最后判斷該產(chǎn)品為合格產(chǎn)品。家兔個(gè)體差異大，對(duì)邊緣產(chǎn)品易造成誤判或漏判，人全血-IL-1β法可以克服這種缺陷，和BET一樣可以設(shè)置陽(yáng)性、陰性對(duì)照組，具有可以標(biāo)準(zhǔn)化、定量的優(yōu)點(diǎn)。甘油果糖注射液對(duì)鱟試劑和細(xì)菌內(nèi)毒素的反應(yīng)有抑制作用，不適用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，而對(duì)人全血-IL-1β法無(wú)干擾作用。凍干用狂犬病疫苗(vero細(xì)胞)因其免疫原性不適合家兔熱原試驗(yàn)，臨床使用濃度對(duì)人全血-IL-1β法有干擾，回收率偏低，稀釋8倍以上可以克服干擾，4批樣品與BET比較結(jié)果一致均合格。人血清蛋白3種方法的結(jié)果一致均合格，回收率符合要求，對(duì)10批合格樣品的檢測(cè)符合率達(dá)到100%。

3 討論

現(xiàn)有熱原檢測(cè)方法有家兔法和鱟法(細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法)［1］。家兔法能檢查出各種熱原，但缺陷很多，如成本高等;對(duì)熱原的靈敏性受家兔的品系、年齡、實(shí)驗(yàn)條件等限制;在注射最大允許體積(10 mL·kg-1)下，家兔法的檢測(cè)限在0.5～3.5 EU·mL-1，個(gè)體差異達(dá)到7倍，而人的發(fā)熱閾值為0.3 EU·mL-1，在家兔最低檢測(cè)限以下;因種屬不一樣并不能反映人體的發(fā)熱情況，即使經(jīng)兔法檢驗(yàn)合格的藥品也引起人體發(fā)熱反應(yīng);不能定量檢測(cè)，也不能得到統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，重復(fù)性比較差;同時(shí)很多藥品不適應(yīng)家兔法，如對(duì)中樞和外周體溫調(diào)節(jié)機(jī)制有作用的藥物［5］。

表1 3種熱原檢測(cè)方法對(duì)幾種樣品的檢測(cè)結(jié)果

甘油果糖注射液對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法有干擾，結(jié)果不成立;凍干狂犬疫苗法定檢查為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，不采用家兔法;“U”表示不符合規(guī)定;“Q”表示符合規(guī)定細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法經(jīng)濟(jì)、快速、簡(jiǎn)便、可定量、可標(biāo)準(zhǔn)化等，已替代80%家兔法檢測(cè)。但鱟作為一種遠(yuǎn)古生物，并非取之不絕，BET法同樣存在倫理和動(dòng)物保護(hù)以及在將來(lái)沒(méi)有足夠來(lái)源的問(wèn)題。而且鱟試劑只能特異性地檢查革蘭陰性菌的內(nèi)毒素，對(duì)其他熱原質(zhì)表現(xiàn)為陰性，而除內(nèi)毒素外有很多的物質(zhì)對(duì)人和動(dòng)物有潛在的致熱性［5］。

為彌補(bǔ)現(xiàn)有熱原檢查方法的不足，一種結(jié)合BET體外高靈敏度和家兔法寬檢測(cè)譜優(yōu)點(diǎn)的新方法被提出來(lái)。人外周血單核細(xì)胞法由全血法發(fā)展而來(lái)，其實(shí)質(zhì)為全血法的一種。在歐洲一共有6種方法系統(tǒng)被正式確認(rèn)而向《歐洲藥典》推薦［6］。新的熱原試驗(yàn)方法重復(fù)性好、靈敏度高、檢測(cè)譜廣、檢測(cè)限完全能滿足熱原檢查的要求，能夠替代傳統(tǒng)熱原試驗(yàn)方法。《歐洲藥典》已成立專家組對(duì)方法考察確認(rèn)，美國(guó)、日本也在開(kāi)展研究［6］。至今，對(duì)新的熱原試驗(yàn)方法研究熱點(diǎn)趨勢(shì)是:早期的人全血法到人單核細(xì)胞系法，近期又轉(zhuǎn)向人全血法，認(rèn)為全血法最能反映人體發(fā)熱反應(yīng)，是最佳方法。

熱原檢查是非腸道給藥藥品生物安全性檢查的重要項(xiàng)目之一，有必要對(duì)此研究并吸收利用國(guó)際研究成果。經(jīng)過(guò)多年的研究，全血法優(yōu)勢(shì)明顯，是最有可能推廣應(yīng)用的方法，故選擇此法進(jìn)行研究、應(yīng)用。在試驗(yàn)中摸索出完成試驗(yàn)所需條件及解決辦法，細(xì)化每一試驗(yàn)步驟以求標(biāo)準(zhǔn)化，為擴(kuò)大范圍的確認(rèn)試驗(yàn)作鋪墊。

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