孔俊豪 楊秀芳 涂云飛 孫慶磊 陳小強(qiáng)

（中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州 310016）

基于SPSS空列正交設(shè)計(jì)的茶黃素動(dòng)態(tài)提制工藝快速優(yōu)化

孔俊豪 楊秀芳﹡涂云飛 孫慶磊 陳小強(qiáng)

（中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州 310016）

以茶多酚為原料，采用動(dòng)態(tài)-雙相萃取法制備茶黃素。運(yùn)用SPSS軟件，以反應(yīng)時(shí)間、多酚氧化酶濃度、水酯兩相比為過程調(diào)控因素進(jìn)行有空白列正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化分析，優(yōu)化后的反應(yīng)條件為：酶濃度1600U/g，水酯兩相比1:0.5，反應(yīng)時(shí)長60min，該反應(yīng)條件下茶黃素的合成均量為846mg，粗品茶黃素組分含量為47%。

空列正交試驗(yàn) 茶黃素 動(dòng)態(tài) 優(yōu)化

茶黃素是紅茶加工過程中經(jīng)兒茶素類氧化聚合形成的具有苯駢卓酚酮結(jié)構(gòu)的高活性二聚體，含量一般在0.5%到2%之間，其含量高低與紅茶品質(zhì)呈正相關(guān)。近年來其確切的生物學(xué)活性及藥理作用已被眾多試驗(yàn)研究所證實(shí)[1-3]，越來越多地應(yīng)用于保健食品、添加劑、臨床醫(yī)藥、高端日化領(lǐng)域，旺盛的市場需求使得茶黃素的離體轉(zhuǎn)化技術(shù)成為學(xué)界研究的熱點(diǎn)之一。

報(bào)道的茶黃素制備方法有化學(xué)氧化法、固定化酶膜法、雙液相氧化法[4-8]，尚未見有分批補(bǔ)料—?jiǎng)討B(tài)萃取的反應(yīng)方式用于實(shí)驗(yàn)。本研究根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)及模式比較，選取了反應(yīng)時(shí)間、酶濃度、水酯兩相比作為主要因素，以減量處理實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)輸入的過程控制，通過SPSS空列設(shè)計(jì)，將復(fù)雜問題簡單化，通過少量試驗(yàn)獲得可信度高的有用信息，從而快速、高效得到優(yōu)化的反應(yīng)工藝參數(shù)，為規(guī)?；苽浼夹g(shù)的實(shí)際應(yīng)用提供有效的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：90%茶多酚（兒茶素含量46%，浙江東方茶葉科技有限公司購買）；鮮葉（龍井43，杭州翠峰茶葉基地提供）。

試劑：乙酸乙酯，AR，杭州雙林化工試劑廠；檸檬酸，AR，如皋市金陵試劑廠；磷酸氫二鈉，AR，湖州湖試化學(xué)試劑有限公司；甲醇，AR，衢州巨化試劑有限公司；聚乙烯聚吡咯烷酮，AR，上海伯奧生物科技有限公司；石英砂，AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；EDTA，AR，天津華特化研科技有限公司；乙腈，HPLC級，天津市康科德科技有限公司；乙酸，AR，湖州湖試化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JPR-2雙層玻璃反應(yīng)釜，杭州歐爾柏維科技有限公司；DHJF-4005低溫恒溫反應(yīng)槽，杭州惠創(chuàng)儀器設(shè)備有限公司；HL-2D數(shù)顯恒流泵，上海滬西分析儀器廠；MJ-250BP02A植物組織搗碎機(jī)，廣州美的生活電器制造有限公司；3K15低溫冷凍離心機(jī)，德國SIGMA公司；MDF-U338低溫冰箱，大連三洋冷鏈有限公司；UV-2102 PC型分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司；H.H.S.11-2K電熱恒溫水浴鍋，上海醫(yī)療器械五廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 PPO酶液提取及活性測定

PPO粗酶液提?。簻?zhǔn)確稱取茶鮮葉25g于植物搗碎機(jī)中，加入pH4.8的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液125mL、石英砂10g、聚乙烯聚吡咯烷酮1.5g，勻漿提取粗酶液，過濾，轉(zhuǎn)速1000r/min離心15min，取上清液，置4℃冰箱備用。

酶活測定方法[9]：取酶上清液1mL，加3mL反應(yīng)混合液（0.1M檸檬酸-磷酸鹽緩沖液：0.1%脯氨酸：1%鄰苯二酚=2:0.4:0.6），于30℃恒溫水浴反應(yīng)10min，平行測定三次。酶活性以單位體積酶液每分鐘OD460增加0.001為一活性單位（U）。

1.3.2 茶黃素濃度測定

準(zhǔn)確移取茶黃素反應(yīng)釜中酯相層溶液5mL，0.45μm膜過濾，70%甲醇定容至 50mL，進(jìn)樣10μg， 以 HPLC 方法（ISO14520-2）進(jìn)行 組分 檢測[10]。流動(dòng)相A：分別將90mL乙腈，20mL乙酸，2mLEDTA加入1000mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，過0.45μm膜。流動(dòng)相B：分別將800mL乙腈，20mL乙酸，2mLEDTA加入1000mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，過0.45μm膜。色譜條件如下：

流動(dòng)相流速：1mL/min，柱溫：35℃，紫外檢測器：λ=278nm

梯度條件：100%A相保持10min→15min內(nèi)由100%A相→68%A相、32%B相保持10min→100%A相

1.3.3 茶黃素動(dòng)態(tài)雙相酶促制備工藝

用pH4.8的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液為水相溶劑，配制茶多酚底物溶液，待用。在雙層玻璃反應(yīng)器內(nèi)加入乙酸乙酯相，然后將1.3.1中的酶清液加入，通入氧氣（12Mpa，0.5L/min），數(shù)顯恒流泵速度40r/min，反應(yīng)器攪拌轉(zhuǎn)速 360r/min，進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束收集反應(yīng)液，低溫冷凍離心機(jī)1000r/min離心20min，收集酯相溶液，記錄準(zhǔn)確體積，轉(zhuǎn)相，冷凍干燥可得茶黃素產(chǎn)品。

1.3.3 SPSS空列設(shè)計(jì)的L9(34)正交實(shí)驗(yàn)

試驗(yàn)反應(yīng)體系條件下，考慮酯相體積和酯相濃度組別之間的差異性，以茶黃素生成量(Y)為工藝考查指標(biāo)，以反應(yīng)時(shí)間(A)、酶濃度(B)、水酯兩相比(C)為考查變量，設(shè)置空列誤差項(xiàng)（D），進(jìn)行四因素三水平L9(34)空列正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)合統(tǒng)計(jì)分析和參數(shù)顯著性評判，以快速確定動(dòng)態(tài)反應(yīng)提制茶黃素的最佳工藝參數(shù)，試驗(yàn)因素表如表1所示。

表1 茶黃素提制優(yōu)化因素水平表Table1 Between-subjects factors for preparation of theaflavins

直接運(yùn)用SPSS16.0軟件進(jìn)行有空列正交設(shè)計(jì)，所有試驗(yàn)均進(jìn)行三次重復(fù)，試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)計(jì)算處理，取均值后輸入SPSS16.0運(yùn)行分析[11-12]。

2 結(jié)果與分析

依據(jù)正交試驗(yàn)組的計(jì)算結(jié)果，進(jìn)行極差分析和方差分析。

表2 茶黃素動(dòng)態(tài)提制試驗(yàn)結(jié)果直觀分析Table2 Range analysis of experiment results for preparation of theaflavins

2.1 極差分析

從直觀分析表2中各因素的極差項(xiàng)R可以看出，試驗(yàn)因素組別范圍內(nèi)，各因素對產(chǎn)物茶黃素合成量及收率影響程度的順序?yàn)椋篈＞B＞C，即反應(yīng)時(shí)間是最主要的影響因素，酶濃度和水酯兩相比是影響相對較次要的因素。根據(jù)各因素水平對應(yīng)的平均值k可以推斷，采用方案A3B3C1可獲得較高的產(chǎn)物量。

在正交表的處理過程中，各因素間交互作用的存在可從空白列（誤差項(xiàng)）中反映出來。本試驗(yàn)條件范圍內(nèi)，主因素之外的第四列（誤差列）極差最小，因而可以初步判定不存在顯著的交互作用以及未考慮到的其它重要因素。

2.2 方差分析

極差分析的局限性在于不能估計(jì)試驗(yàn)過程及試驗(yàn)結(jié)果測定中必然存在的誤差，因而不能區(qū)分某因素各水平間所對應(yīng)的試驗(yàn)結(jié)果，其差異性的來源。采用SPSS軟件進(jìn)行單變量方差分析，以期把因素水平的變化所引起的試驗(yàn)結(jié)果間的差異與誤差的波動(dòng)所引起的試驗(yàn)結(jié)果間的差異區(qū)分開，并給出可靠的數(shù)量估計(jì)。方差分析結(jié)果見表3。

表3 單變量多因素方差分析Table3 Tests of between-subjects effects

方差分析表（表3）對三個(gè)因素（不含空列項(xiàng)）作出了方差分析，可以看出，A的顯著值為0.019，B的顯著值為0.049，在α=0.05水平上均具有顯著意義 （P＜0.05），而C因素不具有顯著性意義（P=0.063＞0.05），由F值的量值比較也可看出。因此試驗(yàn)反應(yīng)體系下反應(yīng)時(shí)間和酶濃度同為影響反應(yīng)的主要因素，反應(yīng)時(shí)間對于茶黃素累積量的顯著性高于酶濃度，水酯兩相對試驗(yàn)結(jié)果的影響較小。

由表4單因素統(tǒng)計(jì)量表分析可知，A選水平3、B選水平3，C的顯著值為0.063，無顯著意義(P＞0.05)，水平 1、2、3 均可，但從節(jié)省能源考慮，以1水平為宜。

表4 單因素統(tǒng)計(jì)量表Table4 Estimated marginal means

綜上方差分析可知，酶催化合成茶黃素的最佳工藝水平為A3B3C1，與極差分析結(jié)果高度吻合。

圖1 酯相層產(chǎn)物的HPLC圖Fig.1 HPLC spectra of product in ethyl acetate phase

圖2 反應(yīng)產(chǎn)物粗品茶黃素的HPLC圖Fig.2 HPLC spectra of crude theaflavins

2.3 驗(yàn)證性試驗(yàn)

為了驗(yàn)證優(yōu)選工藝條件的可靠性和重現(xiàn)性，按照動(dòng)態(tài)反應(yīng)過程控制條件：酶濃度1600U/g，水酯兩相比1:0.5，反應(yīng)時(shí)長60min開展重復(fù)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。收集酯相層溶液 （10倍稀釋樣品HPLC圖譜見圖1），試驗(yàn)平行3次，取均值，計(jì)算轉(zhuǎn)化后茶黃素的合成量為846mg，證明預(yù)測條件下的試驗(yàn)結(jié)果比原先正交試驗(yàn)組合方案要高，說明工藝條件預(yù)測的可靠性較好。經(jīng)過濾轉(zhuǎn)相，冷凍干燥得到茶黃素樣品經(jīng)分析其純度為47%（HPLC圖譜見圖2），優(yōu)于靜態(tài)雙液相酶促氧化法。

3 結(jié)論

將動(dòng)態(tài)酶促反應(yīng)模式引入茶黃素的雙相合成研究，基于產(chǎn)物茶黃素合成量的最大化，采用空列正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對試驗(yàn)的主要因素進(jìn)行顯著性分析，極差分析和方差分析共同表明，反應(yīng)時(shí)間和酶濃度是影響反應(yīng)產(chǎn)物合成量的顯著性因子，而水酯兩相比對反應(yīng)結(jié)果的影響相對較小。獲得的最佳工藝條件是：酶濃度1600U/g，水酯兩相比1:0.5，反應(yīng)時(shí)長60min，經(jīng)驗(yàn)證結(jié)果高于正交試驗(yàn)組中的產(chǎn)物合量。由此可見，通過SPSS空列正交試驗(yàn)及正交分析，所得出的優(yōu)化工藝條件是可靠的，為生產(chǎn)工藝的技術(shù)改進(jìn)提供了試驗(yàn)技術(shù)基礎(chǔ)。

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Fast Optimization of Dynamic Preparation of Theaflavins through Blank Column-Orthogonal Design by SPSS

KONG Jun-hao,YANG Xiu-fang﹡,TU Yun-fei,SUN Qing-lei,CHEN Xiao-qiang
(Hangzhou Tea Research Institute,CHINA COOP,Hangzhou 310016,China)

The preparation technology oftheaflavins with dynamic two-phase system using tea polyphenols as raw material was introduced.The reaction conditions were optimized with blank column orthogonal experiment design by SPSS.The reaction factors such as polyphenol oxidase(PPO)concentration,the ratio of water/ethyl acetate and reaction time were studied.It was indicated that the optimum reaction conditions were as follows.PPO concentration was 1600U/g,the ratio of water/ethyl acetate was 1:0.5,reaction time was for 60min,846 mg of theaflavins were synthesized at the optimum extraction conditions,accordingly,the content of crude product reached 47%.

Blank column-orthogonal,Theaflavins,Dynamic,Optimization

2011-04-26

孔俊豪（1982-），男，河南漯河人，研究實(shí)習(xí)員，主要從事茶葉生物活性物質(zhì)的提純及衍生產(chǎn)品開發(fā)。

﹡通訊作者：teatesting@sina.com