程忠玲，吳效楠

（承德石油高等?？茖W校 化學工程系，河北 承德 067000）

羊棲菜褐藻糖膠的抗凝血和促血管內(nèi)皮細胞生長活性研究

程忠玲，吳效楠

（承德石油高等?？茖W校 化學工程系，河北 承德 067000）

采用乙醇分級沉淀法對酸提法從羊棲菜中提取的粗糖進行純化得到褐藻糖膠。采用體外凝血試驗tAPTT、tTT、tPT評價了褐藻糖膠體外抗凝血活性和MTT染色法檢測褐藻糖膠對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞（HUVEC）生長的促進作用。結(jié)果表明，tAPTT、tTT分別在不同濃度與對照組出現(xiàn)顯著差異，而tPT未出現(xiàn)顯著差異。在10μg/mL～200μg/mL濃度范圍內(nèi)，人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞增殖數(shù)量有大幅度提高，對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞增殖具有明顯促進作用，說明褐藻糖膠是促人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞生長的活性物質(zhì)。

羊棲菜；褐藻糖膠；抗凝血；人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞；MTT染色法

羊棲菜（Sargassum fusiforme Setchel），又名鹿角尖、海大麥，日本稱其為“長壽菜”。多分布在我國沿海，北起遼東半島，南至雷州半島，其中浙江沿海最多。洋棲菜被公認為是當今最有食用價值的海洋藻類，享有“保健珍品”的盛譽，隸屬于褐藻門、馬尾藻科、馬尾藻屬?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明：羊棲菜具有抗腫瘤作用，有促進造血功能和增強免疫功能的功效，防止血栓形成，降低膽固醇和防止高血壓，且這些作用與其中的活性成分褐藻糖膠有關(guān)[1-4]。國內(nèi)研究多集中在提純分離方法上，而對活性成分褐藻糖膠生理活性的研究卻不多。本文采用酸提法從浙江省洞頭縣產(chǎn)羊棲菜中提取粗多糖，采用乙醇分級沉淀法純化得到褐藻糖膠。采用體外凝血試驗部分凝血活酶時間（tAPTT）、凝血酶原時間（tPT）、凝血酶時間（tTT）評價褐藻糖膠的體外抗凝血活性，同時采用MTT染色法檢測對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞HUVEC的增殖情況，為羊棲菜中褐藻糖膠的進一步開發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊棲菜：產(chǎn)自浙江省洞頭縣；部分凝血活酶、凝血活酶、凝血酶：上海醫(yī)科大學華山醫(yī)院技協(xié)生物試劑公司；血漿：北京北太平莊血站；細胞培養(yǎng)基DMEM：美國GIBCO公司；新生牛血清：天津生化制品廠；溴化噻唑藍四唑MTT：美國Sigma公司；無水乙醇、氫氧化鈉、丙酮、甲醛等試劑均為AR。

COAG-A-MATE-XM型半自動四通道凝血儀：美國Organon Tekinikai公司；酶標檢測儀：美國Bio-Rad公司。

1.2 褐藻糖膠的提取與純化

1.2.1 提取

稱取去泥沙、經(jīng)甲醛處理后烘干、粉碎的羊棲菜20 g，加入200 mL水，用HCl調(diào)pH為2.5，于 70℃水浴中攪拌提取3h，調(diào)提取液pH為中性，減壓濃縮，采用70%乙醇沉淀。靜置，離心，沉淀經(jīng)無水乙醇洗滌后，干燥得粗糖。

1.2.2 乙醇分級沉淀法

粗品配成5%水溶液，離心除去不溶物，加乙醇至20%濃度，離心除去沉淀，清液繼續(xù)加乙醇至70%濃度，離心，沉淀用無水乙醇及丙酮浸洗，干燥得純化的褐藻糖膠。

1.3 體外凝血試驗

凝血活酶時間（tPT）的測定：凝血活酶用12.5 mmol的氯化鈣溶液2 mL溶解，混勻后預熱5 min后備用。取80 μL血漿放入比色杯中，加入20 μL褐藻糖膠溶液，37℃預熱3 min，然后將比色杯置于凝血儀測試臺，加入0.2 mL凝血活酶溶液，記錄tPT。

部分凝血活酶時間（tAPTT）的測定：部分凝血活酶用1.5 mL三蒸水溶液溶解，混勻后預熱5 min后備用。取80 μL血漿放入比色杯中，加入20 μL褐藻糖膠溶液，37℃預熱3 min，然后加入0.1 mL部分凝血活酶溶液，活化3 min后，將比色杯置于凝血儀測試臺，加入30 mmol氯化鈣溶液0.1 mL，記錄tAPTT。

凝血酶時間（tTT）的測定：凝血酶用3 mL三蒸水溶解，混勻后預熱5 min后備用。取0.16 mL血漿放入比色杯中，加入40 μL褐藻糖膠溶液，37℃預熱3 min后，將比色杯置于凝血儀測試臺，加入0.2 mL凝血酶試劑，記錄 tTT。

設(shè)4個濃度梯度進行測試，同時設(shè)空白對照組。所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學顯著分析，每個樣本的數(shù)值以平均值（MEAN）±平均標準誤差（SEM）表示，2個樣本以t-student試驗進行比較，P<0.05時為2個樣本之間有顯著性差異。

1.4 MTT法測定細胞生長增殖試驗

在DMEM中培養(yǎng)HUVEC，補加20%新生牛血清，100μg/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

在96孔培養(yǎng)板中每孔中分別接種濃度為1×105個/mL HUVEC細胞0.5 mL，在5%CO2培養(yǎng)箱中于37℃孵育36 h。設(shè)4個濃度梯度加入至96孔板中，每個濃度設(shè)6個平行孔，同時設(shè)空白對照組，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，取出孔板，每孔加入5 mg/mL MTT 50 μL，繼續(xù)孵育4 h后棄去培養(yǎng)液，加入適量的三蒸水使細胞溶脹，每孔再加入適量的0.04 mol/L鹽酸異丙醇細胞裂解液，吹打使藍紫色的結(jié)晶物溶解均勻。在酶標儀上檢測各孔在550 nm的吸光度。所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學顯著分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 體外凝血試驗結(jié)果

凝血時間采用比濁法測試，該法基于當纖維蛋白原變成纖維蛋白，光線穿過血漿時會發(fā)生散射的原理，若血漿凝塊形成，透射光線的散射增加，由探測器探測到的光度會相應(yīng)地減少。

不同質(zhì)量濃度的褐藻糖膠在血漿中的體外凝血時間測定結(jié)果見表1。

表1 不同質(zhì)量濃度的褐藻糖膠在血漿中的體外凝血時間Table 1 In vitro cogulation times of human blood plasma incubated with fucoidan in different mass concentration

實驗血漿樣品的凝血時間tAPTT、tTT、tPT在正常人血漿的體外凝血時間正常范圍內(nèi)[5]。從表1可以看出，在10 μg/mL ～200 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，tAPTT、tTT均有顯著的延長作用，而tPT不及tAPTT、tTT明顯，這與褐藻糖膠的抗凝血機理有關(guān)，褐藻糖膠對內(nèi)源性凝血途徑的影響比外源性凝血途徑的影響更為顯著[6]。隨著褐藻糖膠質(zhì)量濃度的增加，tAPTT、tTT呈上升趨勢，與海帶中提取的褐藻糖膠變化規(guī)律相似[7]。與青島海域海帶中褐藻糖膠的體外凝血時間相比，羊棲菜中褐藻糖膠體外凝血時間tAPTT、tTT明顯延長。褐藻糖膠是一種獨特種類的硫酸基多糖，具有類似肝素的多糖結(jié)構(gòu)。文獻報道褐藻糖膠的硫酸基含量對其抗凝血作用起著重要甚至決定作用[6]。試驗采用的褐藻糖膠硫酸基含量為23.28%，比文獻報道海帶中褐藻糖膠硫酸基含量為19.86%高[8]。肝素在10 μg/mL濃度時，tAPTT和tTT均已超過了儀器的檢測上限值（tAPTT150 s、tTT200 s），與傳統(tǒng)抗凝血劑肝素相比，羊棲菜褐藻糖膠抗凝血活性平穩(wěn)，可被開發(fā)成預防血栓性疾病的保健食品。

2.2 MTT實驗結(jié)果

MTT在活細胞線粒體中的琥珀脫氫酶的催化作用下，被還原為藍紫色結(jié)晶物并沉積在細胞中，而死細胞則無此變化。在一定的細胞數(shù)目范圍內(nèi)，MTT藍紫色結(jié)晶物形成的量與細胞數(shù)目成正比，因此利用酶標儀在550 nm測定細胞裂解液吸光度（OD550 nm）的變化可以間接反映HUVEC的數(shù)量。

不同濃度的褐藻糖膠作用于人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞后，采用MTT法測定其對HUVEC增殖活性的影響情況見表2。

表2 褐藻糖膠對HUVEC增殖活性的影響Table 2 The effect of fucoidan on HUVEC proliferation activity

從表 2 看出，褐藻糖膠在 10 μg/mL～200 μg/mL 濃度范圍內(nèi)比空白對照的OD值顯著增加，且隨著濃度增加，褐藻糖膠對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的生長具有較好的促進作用，出現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。

血管內(nèi)皮細胞HUVEC不僅是血管表面的一層物理屏障，更重要的還是血管內(nèi)皮細胞在維持血管張力和血流調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用，內(nèi)皮細胞還可以阻止血小板和白細胞的激活，所以完整的內(nèi)皮系統(tǒng)在維持血管穩(wěn)定和防止血栓方面發(fā)揮重要作用[9]。但體內(nèi)很多因素都可引起血管內(nèi)皮的損傷,導致其功能改變。當損傷因素不能去除的情況下，血管內(nèi)皮很難通過細胞自然的增殖來進行修復。而血管內(nèi)皮細胞的增殖可以促進血管生成，從而促進傷口愈合[10-11]。本試驗結(jié)果表明，在羊棲菜醇提物褐藻糖膠是具有對血管內(nèi)皮細胞增殖產(chǎn)生促進作用的活性物質(zhì)，為進一步從羊棲菜中分離純化具有保護和修復血管內(nèi)皮細胞的活性物質(zhì)提供了依據(jù)。但要確定硫酸基是否為促人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞生長的藥效團有需進一步研究。

3 結(jié)論

經(jīng)體外凝血實驗和HUVEC細胞增殖實驗發(fā)現(xiàn)，從羊棲菜中分離純化得到的褐藻糖膠在10 μg/mL～200 μg/mL濃度范圍內(nèi)，具有良好的抗凝血活性，具有對血管內(nèi)皮細胞增殖產(chǎn)生促進作用，為羊棲菜中褐藻糖膠的進一步開發(fā)和利用提供依據(jù)。

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Study on the Anticoagulant Activities and Promoting Effect on Human Umbilical Vein Endothelial Cells Proliferation Activity of Fucoidan from Sargassum fusiforme Setchel

CHENG Zhong-ling， WU Xiao-nan
（Department of chemical engineering，Chengde Petroleum College，Chengde 067000，Hebei，China）

Fucoidan from Sargassum fusiforme Setchel was extracted by acid method and purified by fractional precipitation with alcohol.Its anticoagulant activities in vitro and cell proliferation of Human umbilical vein endothelial cells（HUVEC）were appreciated preliminarily by the method of activited partial thromboplastin time（tAPTT），activited thromboplastin time（tPT），thrombin time（tTT）and method MTT staining respectively.It is shown that tAPTT，tTThave Significantly different from the control in different concentration respectively,and tPThas not.The cell proliferation of HUVEC raises more in range of 10 μg/mL-200 μg/mL，It could promote the growth and proliferation of HUVECs significantly.There are some components of promotion growth of HUVECs in the fraction from Sargassum fusiforme Setchel.

Sargassum fusiforme Setchel;fucoidan;Anticoagulant；HUVEC；method MTT staining

河北省科學技術(shù)研究與發(fā)展指導項目（05215512）

程忠玲（1969—），女（漢），副教授，碩士，主要從事天然多糖的提取、抗凝血藥物和生物材料的研究。

2010-08-10