宋芹 ，顏軍 ，郭曉強(qiáng) ，姚倩 ，郁小兵

（1.成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院，四川 成都 610106；2.日本高研株式會(huì)社研究所，東京1150051）

酶法制取羅非魚(yú)魚(yú)鱗膠原蛋白寡肽的工藝

宋芹1，顏軍1，郭曉強(qiáng)1，姚倩1，郁小兵2，*

（1.成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院，四川 成都 610106；2.日本高研株式會(huì)社研究所，東京1150051）

利用酶工程技術(shù)，以羅非魚(yú)魚(yú)鱗為研究對(duì)象，研究開(kāi)發(fā)羅非魚(yú)魚(yú)鱗膠原蛋白寡肽制品。以蛋白酶種類、底物濃度、酶解時(shí)間、加酶量、溫度、pH為實(shí)驗(yàn)因素，以膠原蛋白的提取率、平均分子量等為指標(biāo)，確定酶解最佳條件為：在pH6，溫度50℃，底物濃度150 g/L，加酶量1%MG+1%HHM的條件下，水解12 h，可得膠原提取率為55%，平均分子量為920 u左右。

羅非魚(yú)魚(yú)鱗；復(fù)合酶；水解；膠原蛋白寡肽

膠原蛋白具有美容、抗骨質(zhì)疏松、降血壓、抗氧化等多種生物活性，被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品、保健品等高附加值領(lǐng)域。研究表明，膠原蛋白能改善皮膚的彈性和柔軟度，具有幫助皮膚保濕的作用，對(duì)皮膚刺激、紫外線照射引起的皮膚疾患有良好的改善作用[1-3]。膠原蛋白還能有效增加骨密度、增強(qiáng)骨強(qiáng)度[4]。利用先進(jìn)的現(xiàn)代生物技術(shù)，從水產(chǎn)廢棄物中提取膠原多肽，生產(chǎn)具有各種生理功能的活性肽，不僅能促進(jìn)水產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，還可提高人們醫(yī)療健康水平。如何從膠原中提取活性肽，已是這一領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

羅非魚(yú)屬于廣鹽性魚(yú)類，海淡水中均可養(yǎng)殖，它耐低氧，易于養(yǎng)殖，已被視為傳統(tǒng)魚(yú)類的替代品種，正日漸受到歐、美、日市場(chǎng)的青睞，羅非魚(yú)也因此而成為世界性的主要養(yǎng)殖魚(yú)類[5]。隨著羅非魚(yú)養(yǎng)殖的擴(kuò)大，加工中產(chǎn)生的廢棄物也逐年上升。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2007年，我國(guó)羅非魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)121萬(wàn)t，占全球的55%[6]。因此，對(duì)水產(chǎn)廢棄物進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用，使其變廢為寶，既可以帶來(lái)良好的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益，也能促進(jìn)環(huán)境保護(hù)。

為了確保多肽對(duì)人體的安全性和有效性，一般采用酶解法進(jìn)行活性肽的提取。影響酶解效果的因素主要有：酶的種類、加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間、pH及底物濃度（料水比）等。本試驗(yàn)將首次從以上幾個(gè)方面研究羅非魚(yú)魚(yú)鱗中膠原寡肽的酶解方法，提取低分子活性肽，使羅非魚(yú)資源得以合理開(kāi)發(fā)利用，提高其加工的綜合效益及經(jīng)濟(jì)附加值。

1 材料、試劑與儀器

羅非魚(yú)干燥魚(yú)鱗：海南水產(chǎn)品市場(chǎng)；蛋白酶MG：日本天野エンザイム株式會(huì)社；復(fù)合蛋白酶HHM（膠原蛋白復(fù)合酶）：日本高研株式會(huì)社主席研究員郁小兵博士提供；蛋白酶F3G：日本天野エンザイム株式會(huì)社；蛋白酶FG-F：日本天野エンザイム株式會(huì)社；胞嘧啶核苷Cytidine：和光純藥工業(yè)株式會(huì)社LotTCH 3764；細(xì)胞色素C（Cytochrome C）：和光純藥工業(yè)株式會(huì)社LotPKN7103；VitaminB12：和光純藥工業(yè)株式會(huì)社LotALC1200；酪蛋白：和光純藥工業(yè)株式會(huì)社LotWAG 7059；三氯乙酸：關(guān)東化學(xué)株式會(huì)社 Lot701S1207；K2HPO4：和光純藥工業(yè)株式會(huì)社 LotWDM3773；KH2PO4：和光純藥工業(yè)株式會(huì)社LotDWK6099；羥脯氨酸，氯胺T，檸檬酸，氫氧化鈉，醋酸鈉，正丙醇，對(duì)二甲氨基苯甲高氯酸，異丙醇，硫酸等試劑，均為分析純。LC-9A shimaDZU/C-R7A高效液相色譜儀：日本島津公司；UV-1601型紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；METTLER－AE100型電子天平：瑞士METTLER公司。

2 提取操作步驟

1）預(yù)處理：將洗凈干燥后的魚(yú)鱗適當(dāng)粉碎，稱取20 g，加入200 mL蒸餾水，再往溶液中滴加6 mol/L HCl，檢測(cè)溶液 pH，直到 pH 不再變化為止（pH＝2），約消耗6 mol/L HCl 20 mL，浸泡2 h后，棄去溶液，用水沖洗。往樣品中加入適量蒸餾水，密封，121℃，20 min濕熱滅菌。

2）酶解：在一定溫度、pH等條件下，采用蛋白質(zhì)分解酶對(duì)魚(yú)鱗膠原蛋白寡肽進(jìn)行提取。

3）滅活：將樣品于80℃下，15 min滅活。

4）減壓抽濾：當(dāng)樣品溫度降至室溫，進(jìn)行減壓抽濾，濾紙孔徑約50 μm。

5）冷凍干燥：于-40℃冷凍樣品后，凍干室減壓至50 Pa，加熱板溫度50℃，12 h，冷凍干燥。所得粉末為膠原蛋白短肽。

3 膠原蛋白提取率的測(cè)定

膠原蛋白含量以羥脯氨酸的含量換算，膠原蛋白含量等于羥脯氨酸含量乘以系數(shù)11.1（通過(guò)氨基酸成分分析得出，羥脯氨酸含量為占總氨酸含量的9%左右）。羥脯氨酸是膠原蛋白的一種特性蛋白質(zhì)，通過(guò)0、12.5、25、50、100 μg/mL 5 種不同濃度的羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品經(jīng)氧化脫羧反應(yīng)生成吡咯，以對(duì)二甲氨基苯甲醛顯色，測(cè)定558 nm處的吸光度，以濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得回歸方程為y=0.0141x+0.0041，r=0.999。結(jié)果表明，羥脯氨酸含量在0～100 μg/mL之間與吸光度呈良好的線性關(guān)系。按以下公式計(jì)算膠原蛋白提取率。

膠原純度=11.1ml/m2×100%

式中：m1為測(cè)定的羥脯氨酸質(zhì)量，g；m2為測(cè)定時(shí)稱取的樣品質(zhì)量，g。

膠原蛋白提取率=（膠原純度×M1/M2)×100%

式中：M1為成品的質(zhì)量，g；M2為魚(yú)鱗的質(zhì)量，g。

4 凝膠柱色譜法測(cè)定平均分子量

在色譜柱Superdex Peptide 10/300 GL、柱溫25℃、流速 0.5 mL/min、進(jìn)樣量 50 μL、以 0.02 mol/L phosphate buffer，0.25 mol/L NaCl，pH7.2 為流動(dòng)相的色譜條件下，在214 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品或標(biāo)準(zhǔn)品細(xì)胞色素C （Cytochrome C,0.25 mg/mL），VB12（Vitamin B12，0.025 mg/mL），胞嘧啶核苷（Cytidine,0.025 mg/mL）的保留時(shí)間，以各標(biāo)準(zhǔn)品峰的保留時(shí)間（min）為橫坐標(biāo)，分子量的對(duì)數(shù)（logMr）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得線性回歸方程：y=-0.0743x+5.6301，r=0.998。按以下公式計(jì)算平均分子量。

平均分子量的計(jì)算：

式中：Mrn為色譜圖中第n個(gè)峰的分子量，u；an%為色譜圖中第n個(gè)峰占總峰面積的百分?jǐn)?shù)，%。

5 結(jié)果

5.1 酶的種類

選擇比較了蛋白酶MG（米曲霉Aspergillus oryzae菌株）、復(fù)合蛋白酶HHM、蛋白酶F3G（根霉Rhizopus niveus菌株）、蛋白酶FG－F（枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis）以及MG和HHM的混合酶對(duì)魚(yú)鱗膠原蛋白的水解情況。按說(shuō)明書(shū)，分別以各酶的最佳酶解條件，復(fù)合酶采用取兩種酶的平均酶解參數(shù)，對(duì)預(yù)處理后的羅非魚(yú)魚(yú)鱗進(jìn)行酶解，按2項(xiàng)下操作步驟對(duì)樣品進(jìn)行滅活、減壓過(guò)濾、冷凍干燥。計(jì)算各條件下膠原蛋白的提取率及平均分子量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各種酶的水解效果比較Table 1 Comparison of the hydrolysis effect of various enzymes

由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，利用復(fù)合酶MG+HHM水解，在相同的時(shí)間內(nèi)提取率最高，且平均分子量較小，能得到較多10個(gè)氨基酸以下的寡肽（1個(gè)氨基酸的分子量約為100），故采用MG（米曲霉Aspergillus oryzae菌株）和復(fù)合蛋白酶HHM進(jìn)行酶解。

5.2 溫度的影響

按照底物質(zhì)量濃度150 g/L，加酶量1%MG+1%HHM，pH6的條件，分別在 40、45、50、55、60℃對(duì)羅非魚(yú)魚(yú)鱗進(jìn)行水解，反應(yīng)12 h后，按2項(xiàng)下操作步驟對(duì)樣品進(jìn)行滅活、減壓過(guò)濾、冷凍干燥。測(cè)定膠原蛋白提取率和平均分子量。結(jié)果見(jiàn)圖1、2。

圖1 溫度對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.1 The effects of temperature on extraction ratio of peptid

圖2 溫度對(duì)膠原蛋白平均分子量的影響Fig.2 The effects of temperature on average molecular

由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，溫度對(duì)魚(yú)鱗水解反應(yīng)影響較大。在45℃～50℃時(shí)水解度隨著溫度升高不斷增大，當(dāng)溫度高于50℃時(shí)水解度開(kāi)始下降。這是因?yàn)闇囟葘?duì)酶解反應(yīng)速度具有雙重影響，升高溫度可加快酶解反應(yīng)速度，同時(shí)當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，酶容易變性，酶活力容易降低。由圖1、2可知在溫度50℃時(shí)，膠原蛋白的提取率最高、平均分子量最低，故采用溫度為50℃進(jìn)行酶解。

5.3 底物濃度的影響

在pH6，溫度50℃，加酶量1%MG+1%HHM的條件下，分別以底物濃度50、100、150、200 g/L進(jìn)行水解，反應(yīng)12 h后，按2項(xiàng)下操作步驟對(duì)樣品進(jìn)行滅活、減壓過(guò)濾、冷凍干燥。計(jì)算膠原蛋白提取率和平均分子量。結(jié)果見(jiàn)圖3、4。

圖3 底物濃度對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.3 The effects of substrate concentration on extraction ratio of peptid

圖4 底物濃度對(duì)膠原蛋白平均分子量的影響Fig.4 The effects of substrate concentration on average molecular weight of peptid

由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在底物質(zhì)量濃度為50 g/L～150 g/L時(shí)提取率隨底物質(zhì)量濃度的增加而增大。這是因?yàn)槊附夥磻?yīng)最終達(dá)到一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，在底物質(zhì)量濃度較低時(shí)，根據(jù)酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，反應(yīng)速度隨底物質(zhì)量濃度的增加而增大，使反應(yīng)平衡向產(chǎn)物方向移動(dòng)，所以提取率的增加也較快。但是當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度進(jìn)一步增大，酶的活性中心逐漸被底物所飽和時(shí)，增加底物質(zhì)量濃度提取率也不會(huì)增加，反而影響反應(yīng)速度，使提取率降低。所以當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度超過(guò)150 g/L時(shí)提取率開(kāi)始下降。由圖可知，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度在100 g/L～200 g/L范圍內(nèi)時(shí)，提取率較大。同時(shí)對(duì)膠原蛋白短肽的平均分子量并沒(méi)有太大的影響。故采用底物濃度150 g/L進(jìn)行酶解。

5.4 加酶量的影響

在pH6，溫度50℃，底物濃度150 g/L的條件下，分別以加比例的復(fù)合酶進(jìn)行水解，反應(yīng)12 h后，按3項(xiàng)下操作步驟對(duì)樣品進(jìn)行滅活、減壓過(guò)濾、冷凍干燥。計(jì)算膠原蛋白提取率和平均分子量。結(jié)果見(jiàn)圖5、6。

圖5 加酶量對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.5 The effects of enzymes'dosage on extraction ratio of peptid

圖6 加酶量對(duì)膠原蛋白平均分子量的影響Fig.6 The effects of enzymes'dosage on average molecularweight of peptid

由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，加酶量1%MG+1%HHM或2%MG+2%HHM時(shí)水解產(chǎn)物中膠原的含量最高。在加酶量超過(guò)1%MG+1%HHM后，提取率的增加變得緩慢。這是因?yàn)楫?dāng)酶的濃度相對(duì)于底物濃度較低的情況下，加大酶的用量可以有效加快酶解反應(yīng)速度，但當(dāng)酶的濃度相對(duì)于底物濃度較高情況下，反應(yīng)速率開(kāi)始由底物濃度控制，所以繼續(xù)增加酶的用量對(duì)提取率影響較小，考慮到生產(chǎn)成本，選擇加酶量為1%MG+1%HHM。

5.5 pH的影響

在溫度50℃，底物濃度150 g/L，加酶量1%MG+1%HHM 的條件下，分別以 pH5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，進(jìn)行水解，反應(yīng)12 h后，按2中3）操作步驟對(duì)樣品進(jìn)行滅活、減壓過(guò)濾、冷凍干燥。計(jì)算膠原蛋白提取率和平均分子量。結(jié)果見(jiàn)圖7、8。

由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)pH為6時(shí)，提取率最高，平均分子量最小，說(shuō)明復(fù)合酶的活性和穩(wěn)定性與pH密切相關(guān)，因此選擇酶解pH為6。

圖7 pH對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.7 The effects of pH on extraction ratio of peptid

圖8 pH對(duì)膠原蛋白平均分子量的影響Fig.8 The effects of pH on average molecular weight of peptid

5.6 時(shí)間的影響

在pH6，溫度50℃，底物濃度150 g/L，加酶量1%MG+1%HHM的條件下，進(jìn)行水解，分別反應(yīng)2、4、8、12、16 h后，按3項(xiàng)下操作步驟對(duì)樣品進(jìn)行滅活、減壓過(guò)濾、冷凍干燥。計(jì)算膠原蛋白提取率和平均分子量。結(jié)果見(jiàn)圖 9、10。

圖9 反應(yīng)時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.9 The effects of reaction time on extraction ratio of peptid

圖10 反應(yīng)時(shí)間對(duì)膠原蛋白平均分子量的影響Fig.10 The effects of reaction time on average molecular weight of peptid

由以上試驗(yàn)結(jié)果可知，復(fù)合酶在反應(yīng)初期0～4 h內(nèi)，活性較高，提取率增大較快，產(chǎn)物平均分子量的變化也最快，在反應(yīng)進(jìn)行12 h后，達(dá)到頂峰，此時(shí)，水解物平均分子量在1000 u以內(nèi)，考慮到成本以及反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致雜菌繁殖，故確定反應(yīng)時(shí)間為12 h。

6 結(jié)論

通過(guò)對(duì)各酶解條件的水解產(chǎn)物膠原蛋白的提取率、平均分子量的考察，最終確定從羅非魚(yú)魚(yú)鱗中提取膠原蛋白的最佳條件為：在pH6，溫度50℃，底物濃度150 g/L，加酶量1%MG+1%HHM的條件下，水解12 h。在此條件下，提取率能達(dá)到55%左右，平均分子量約為920u，10個(gè)氨基酸以下的寡肽占較大比重，見(jiàn)圖11。

圖11 樣品GPC色譜圖Fig.11 GPC chromatography of sample

蛋白質(zhì)水解物的生產(chǎn)方式分為化學(xué)降解法和酶降解法?；瘜W(xué)法是用酸、堿等化學(xué)試劑在一定溫度下促使蛋白質(zhì)分子的肽鏈斷裂形成小分子物質(zhì)?；瘜W(xué)法反應(yīng)強(qiáng)烈，污染環(huán)境，水解使氨基酸大多消旋，如使L-氨基酸形成D-氨基酸，形成有毒物質(zhì)，無(wú)生物利用價(jià)值，因此不宜采用[7]。隨著酶制劑工業(yè)的迅猛發(fā)展，酶解法被廣泛采用，所得產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，以多肽為主，速溶性好，易于人體消化吸收，同時(shí)由于其特有的活性功能，酶解法提取膠原蛋白多肽已經(jīng)成為發(fā)展趨勢(shì)。

酶解反應(yīng)是一個(gè)化學(xué)過(guò)程，具有一個(gè)動(dòng)態(tài)的平衡，pH值、溫度、底物濃度、酶濃度等因素均能影響酶解平衡反應(yīng)的效率，因此研究者大多都從這幾個(gè)方面來(lái)研究膠原的酶解條件。本試驗(yàn)采用的是一組復(fù)合酶，其特點(diǎn)便是能得到較小分子量的膠原短肽。通過(guò)對(duì)羅非魚(yú)魚(yú)鱗膠原蛋白短肽的提取方法的探討，從其中提取出平均分子量在1000 u以下的膠原蛋白寡肽，并將對(duì)其活性進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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Study on Extracion Technology of Tilapia Fish Scale Collagen Oligopeptide

SONG Qin1，YAN Jun1，GUO Xiao-qiang1，YAO Qian1，YU Xiao-bing2,*
（1.College of Faculty of Biotechnology Industry，Chengdu University，Chengdu 610106，Sichuan，China；2.Koken Bioscience Institute，Tokyo 1150051，Japan）

The collagen peptid from Tilapia fish scale has been extracted by using pepsin method.The effects of six factors including enzymatic species,enzyme concentration,substrate concentration,hydrolyzing time,temperature and pH.The best enzymatic hydrolysis condition was determined based on extraction ratio and average molecular weight of peptid.The optimum condition of enzymatic species,enzyme concentration，substrate concentration,hydrolyzing time,temperature and pH for the collagen peptid as 1%MG+1%HHM,150 g/L,12 h,50℃,pH6.The extraction ratio is 55%and average molecular weight of peptid is 920 u by this pepsin method.

tilapia fish scale;compound enzyme;hydrolysis;collagen oligopeptide

*通信作者：郁小兵（1959—），男（漢），教授，博士，日本文部省特別研究員。

宋芹（1982—），女（漢），講師，博士，研究方向：天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)。

2010-04-03