劉志楠，喻東威，趙源，劉曉川，李梅，趙雅麗

（內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司質(zhì)量管理系統(tǒng)分析檢測(cè)中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 011500）

5種水溶性維生素在奶粉中的穩(wěn)定性研究

劉志楠，喻東威，趙源，劉曉川，李梅，趙雅麗

（內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司質(zhì)量管理系統(tǒng)分析檢測(cè)中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 011500）

微生物法檢測(cè)奶粉中水溶性維生素，為美國(guó)公職分析化學(xué)家協(xié)會(huì)AOAC要求的官方檢測(cè)方法，也為國(guó)標(biāo)所采納，一直沿用至今。其靈敏度高，已被全世界所公認(rèn)。但該法操作復(fù)雜，影響結(jié)果的因素很多，對(duì)檢驗(yàn)人員和實(shí)驗(yàn)室的要求較高。針對(duì)這一問(wèn)題采取對(duì)同一樣品進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)，以確定其波動(dòng)性，為乳制品的檢測(cè)提供有力的數(shù)據(jù)支持。選取同一包奶粉進(jìn)行多次重復(fù)測(cè)定，觀察其樣品與平均值的分布情況，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差以及CV值。煙酸、泛酸、葉酸、VB12穩(wěn)定性較好，生物素相對(duì)次之；煙酸和泛酸重復(fù)測(cè)定的精密度最好，葉酸和VB12相對(duì)較好，生物素精密度次之。

微生物法；煙酸；泛酸；葉酸；VB12；生物素；CV 值

維生素是維持生物正常生命過(guò)程所必需的一類(lèi)小分子有機(jī)物，需要量很少，但對(duì)維持健康十分重要。維生素不能供給機(jī)體熱能，也不能作為構(gòu)成機(jī)體組織的相應(yīng)物質(zhì)，其主要功能是通過(guò)作為輔酶的成分調(diào)節(jié)機(jī)體代謝。大多數(shù)的維生素體內(nèi)一般不能合成或合成量不能滿(mǎn)足生理需要，必須從食物中攝取。長(zhǎng)期缺乏任何一種維生素都會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的疾病。

水溶性維生素也叫B族維生素，包括煙酸、泛酸、葉酸、VB12、生物素等12種水溶性維生素。多數(shù)維生素的性質(zhì)不穩(wěn)定，對(duì)光、氧、熱、pH等非常敏感，食物在加工、儲(chǔ)存、運(yùn)輸、銷(xiāo)售等一系列環(huán)節(jié)都可能造成維生素的損失。為了彌補(bǔ)這種損失，維生素常常作為強(qiáng)化劑在食品工業(yè)的某些產(chǎn)品中使用。將合成的B族維生素添加到食品中補(bǔ)償人體生長(zhǎng)和健康的需要已經(jīng)成為一種世界范圍內(nèi)的行動(dòng)。

維生素是在食品中添加的微量生物活性成分，必須通過(guò)檢測(cè)來(lái)嚴(yán)格控制其在食品中的添加量。由于維生素通常是預(yù)混在食品中，所以具體的檢測(cè)工作常常在添加到食品之前進(jìn)行；當(dāng)然對(duì)于儲(chǔ)存一段時(shí)間后的食品，還應(yīng)在之后重新檢測(cè)。

此外，為了評(píng)價(jià)食品標(biāo)簽上標(biāo)注成分的準(zhǔn)確性。美國(guó)食品和藥物管理局FDA規(guī)定維生素在食品中的實(shí)際添加量必須為標(biāo)簽上標(biāo)注量的100%或更多,而原生維生素產(chǎn)品中的維生素含量必須為標(biāo)簽上標(biāo)注量的80%或更多（合理的超出部分通常認(rèn)為是廠(chǎng)家在正常生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)的）,European Directive2002/46/EC也制定了一系列法規(guī),用于檢測(cè)添加過(guò)維生素的食品中標(biāo)注的維生素含量[1]。

2010年我國(guó)針對(duì)食品安全體系存在的一些列問(wèn)題作出了相應(yīng)的規(guī)定，出臺(tái)了最新國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)作為檢測(cè)乳品中各種營(yíng)養(yǎng)素的國(guó)家強(qiáng)制性檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，國(guó)標(biāo)GB5413-2010[2-6]《乳產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)及標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法》對(duì)嬰幼兒配方食品與奶粉中維生素含量的檢測(cè)方法、檢測(cè)限度、適用范圍等都做了明確的規(guī)定。

目前我國(guó)維生素檢測(cè)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)涉及的方法有微生物法和高效液相色譜法。其中微生物法為水溶性維生素通用方法，為煙酸、泛酸、葉酸、VB12、生物素所共用，高效液相色譜法僅應(yīng)用于煙酸和泛酸。

1 材料與方法

1.1 材料

奶粉。

1.2 試劑及設(shè)備

VB12、煙酸、葉酸、泛酸、生物素檢測(cè)培養(yǎng)基及標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)于中科院微生物研究所；無(wú)菌雙蒸水，酶標(biāo)儀（630 nm）。超凈臺(tái)；微量移液器（100 μL～1000 μL、20 μL～200 μL）；一次性無(wú)菌濾膜（0.22 μm）；一次性無(wú)菌注射器。

1.3 菌種

德式乳桿菌Lactobacillusdelbrueckii.（ATCC7830）；植物乳酸桿菌Lactobacillus plantarum（ATCC 8014）；鼠李糖乳桿菌 Lactobacillus rhamnosus（ATCC 7469）。

1.4 方法

微生物培養(yǎng)法：某些菌體生長(zhǎng)對(duì)某種特定維生素具有較強(qiáng)的依賴(lài)性。配制選擇性的培養(yǎng)基，即含有菌體生長(zhǎng)除待測(cè)維生素以外的所有營(yíng)養(yǎng)元素。待測(cè)維生素添加的多少直接影響菌體的生長(zhǎng)情況。通過(guò)添加不同濃度的待檢測(cè)維生素作為標(biāo)注曲線(xiàn)，就可以半定量判定樣品中的特定維生素的含量，最后通過(guò)細(xì)菌生長(zhǎng)的濁度顯示出來(lái)。

1.5 前處理

取1 g樣品至50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入雙蒸水39 mL，漩渦混勻。在超凈臺(tái)中用0.22 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾至1.5 mL或2.0 mL無(wú)菌試管中。

1.6 培養(yǎng)基制備

加入10 mL無(wú)菌水至維生素培養(yǎng)基中，蓋好瓶蓋，搖勻。在90℃～100℃水浴中加熱至少5 min，其間振蕩至少2次（保證瓶子封閉），迅速冷卻至室溫（低于30℃）。使用0.22 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾培養(yǎng)基至15 mL無(wú)菌離心管中。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)品配制

VB12、煙酸、葉酸、泛酸、生物素標(biāo)準(zhǔn)品用無(wú)菌水配置成不同的濃度梯度，以無(wú)菌雙蒸水為參比，在630 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.8 檢測(cè)步驟

取出需要數(shù)量的微孔板條并在板上固定，未使用的微孔板條立即放回原來(lái)的箔袋中，并與干燥劑一起重新封好，儲(chǔ)存在2℃～8℃條件下；用移液器吸取150μL待檢維生素培養(yǎng)基至微孔中；用移液器吸取150 μL標(biāo)準(zhǔn)品或樣品至指定的微孔中；用粘合箔蓋住微孔條或微孔；除去粘合箔上的保護(hù)層，將其平放在微孔條上，用手或壓舌板將粘合箔平壓，使其充分封閉微孔板條，保證粘合箔和微孔的封閉性，特別注意微孔的邊緣部分；在（37±1）℃黑暗條件下（可用孵育器）孵育20 h～48 h。

1.9 測(cè)量及計(jì)算

用酶標(biāo)儀630 nm條件下讀取混濁度。使用維生素專(zhuān)用軟件進(jìn)行計(jì)算（4P法）。

2 結(jié)果

2.1 不同項(xiàng)目樣品檢測(cè)數(shù)值統(tǒng)計(jì)情況

對(duì)泛酸、煙酸、VB12、葉酸、生物素等5種維生素的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、RSD和CV值的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 同一奶粉檢測(cè)不同項(xiàng)目統(tǒng)計(jì)數(shù)值Table 1 The statistic value of different item for the same milk power sample

表1結(jié)果顯示：煙酸和VB12的CV值均為5%，精密度最高。泛酸和葉酸CV值均為7%，精密度緊隨其后。生物素的精密度相對(duì)較低，CV值為14%。

2.2 不同項(xiàng)目樣品檢測(cè)數(shù)值與平均值的偏離情況

對(duì)泛酸、煙酸、VB12、葉酸、生物素等5種維生素的平均值進(jìn)行橫向的比較，橫線(xiàn)為各檢測(cè)項(xiàng)目的平均數(shù)值。結(jié)果見(jiàn)圖1～圖5。

如圖1～圖5所示：樣品結(jié)果成不規(guī)則分布，生物素結(jié)果分布的較為開(kāi)闊，總體數(shù)值與平均值偏移較大。其余項(xiàng)目結(jié)果相對(duì)較好。

圖1 泛酸檢測(cè)同一樣品散點(diǎn)圖Fig.1 The same sample scatterplot of pantothenic acid determination

圖2 煙酸檢測(cè)同一樣品散點(diǎn)圖Fig.2 The same sample scatterplot of nicotinic acid determination

圖3 VB12檢測(cè)同一樣品散點(diǎn)圖Fig.3 The same sample scatterplot of vitamin 12 determination

圖4 葉酸檢測(cè)同一樣品散點(diǎn)圖Fig.4 The same sample scatterplot of folic acid determination

圖5 生物素檢測(cè)同一樣品散點(diǎn)圖Fig.5 The same sample scatterplot of biotin determination

3 結(jié)果與討論

實(shí)驗(yàn)對(duì)同一樣品不同項(xiàng)目進(jìn)行30個(gè)組份的測(cè)試，目的在于觀測(cè)微生物法檢測(cè)水溶性維生素的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示：煙酸、VB12、泛酸、葉酸的CV值均小于10%，符合國(guó)標(biāo)所要求的在重復(fù)性條件下獲得的2次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。

就樣品性質(zhì)而言煙酸（煙酰胺）性質(zhì)非常穩(wěn)定，數(shù)據(jù)結(jié)果重復(fù)性很好，CV值為5%。其次VB12的CV值也達(dá)到了5%，精密度煙酸和VB12為最好。泛酸和葉酸CV值均為7%，精密度緊隨其后，但葉酸相對(duì)而言對(duì)光較為敏感，操作時(shí)要相對(duì)注意一些，以防止其見(jiàn)光分解。生物素相對(duì)于其他4種而言變化相對(duì)較大，CV值為14%。生物素的測(cè)定方法眾多，微生物法非常靈敏，但由于其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的影響，所以并非都能達(dá)到高準(zhǔn)確性[7]。除生物素外，幾種維生素檢測(cè)結(jié)果與平均值偏離的范圍均比較小。方法重現(xiàn)性和人員的操作過(guò)程都在可以接受的范圍內(nèi)。葉酸來(lái)源于綠葉蔬菜,缺乏時(shí)可引起細(xì)胞性貧血和粒細(xì)胞減少,尤其對(duì)于處于生長(zhǎng)發(fā)育旺盛期的嬰幼兒,如果缺少足夠的葉酸,生長(zhǎng)就會(huì)受到嚴(yán)重影響。孕婦在懷孕期間一般都需要補(bǔ)充葉酸，以防止胎兒畸形的產(chǎn)生。所以葉酸的檢測(cè)準(zhǔn)確性尤為重要。

食品中維生素的測(cè)定方法是以?xún)x器分析法為主，但對(duì)于少數(shù)幾種維生素由于其含量甚微，低于儀器的最低檢出限，目前仍然依靠微生物法進(jìn)行測(cè)定。但微生物法不易掌握，因此將在測(cè)定中積累的一些經(jīng)驗(yàn)歸納總結(jié)，對(duì)食品企業(yè)或?qū)I(yè)實(shí)驗(yàn)室的維生素微生物法測(cè)定大有裨益。

[1]雷濤，張輝，韓惠雯，等.嬰幼兒配方奶粉中水溶性維生素的檢測(cè)方法研究[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2004(2):81

[2]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB 5413.15-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中煙酸和煙酰胺的測(cè)定[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010：3-7

[3]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB 5413.17-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中泛酸的測(cè)定[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010：1-4

[4]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB 5413.14-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測(cè)定北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010：1-4

[5]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB 5413.16-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中葉酸（葉酸鹽活性）的測(cè)定[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010：1-6

[6]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB 5413.19-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中游離生物素的測(cè)定[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010：1-4

[7]刁力蘭，李秀珍，楊平平，等.生物素測(cè)定方法的分析[J].食品與發(fā)酵工程，2007，33(6)：107

The Stable Study on Five Water-soluble Vitamin in Milk

LIU Zhi-nan,YU Dong-wei,ZHAO Yuan,LIU Xiao-chuan,LI Mei,ZHAO Ya-li
（Inner Mongolia mengniu dairy industry（group）limited company quality management department analysis test center Huhhot 011500,Inner Mongolia,China）

The microbiological method for assay of vitamin in milk power is the method of the AOAC official requirement,which is also adopted and continued up to now in Chinese national standard.It’s high sensitivity was generally accepted by the world,while the method raise relatively high demand for laboratory and analyst for its complicated operation and much influencing factors.For the question,we made lots of experiments to detect a sample to definite the fluctuation and provide suitable data.Repeated detected the same milk power sample and viewed the value distribution of the sample,the average,the relative standard deviation and the CV.Nicotinic acid,pantothenic acid,folic acid and Vitamin12 possess better stability than biotin;nicotinic acid and pantothenic acid were the best in precision,folic acid and vitamin12 were better than biotin.

microbiological method;nicotinic acid;pantothenic acid;folic acid;Vitamin12;biotin;CV value

劉志楠（1982—），男（蒙），分析研究員，碩士研究生，研究方向：食品檢測(cè)與分析。

2010-09-25