高麗娟，甕紹蘇，劉清珺，張經(jīng)華，陳爾凝，白羽，韓北忠

（1.北京市理化分析測(cè)試中心，北京，100089；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 100083）

鮮豬肉中沙門氏菌生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型的建立

高麗娟1，2，甕紹蘇1，劉清珺1，張經(jīng)華1，陳爾凝1，白羽1，韓北忠2，*

（1.北京市理化分析測(cè)試中心，北京，100089；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 100083）

以新鮮豬肉濾汁為培養(yǎng)液，接種沙門氏菌，繪制沙門氏菌在17、25、30、35、37℃下的生長(zhǎng)曲線。一級(jí)模型分別使用Logistic和Baranyi模型擬合。二級(jí)模型以Ratkowsky方程為基礎(chǔ)，代入Baranyi模型擬合數(shù)據(jù)，描述了溫度對(duì)最大生長(zhǎng)速率的影響。二級(jí)模型通過殘差圖、準(zhǔn)確因子、偏差因子以及預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值對(duì)比圖進(jìn)行了檢驗(yàn)，結(jié)果顯示殘差在±0.05之間，準(zhǔn)確因子為1.0464，偏差因子為0.9933，預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值比較接近。

沙門氏菌；生長(zhǎng)模型；豬肉；Logistic模型；Baranyi模型；Ratkowsky模型

沙門氏菌引起的疾病是公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義的人畜共患病之一。沙門氏菌屬腸桿菌細(xì)菌科，兼性厭氧，包括鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌和腸炎沙門氏菌等[1]。鮮肉及肉制品營(yíng)養(yǎng)豐富，有適合微生物生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)條件（包括碳源、氮源、水和無機(jī)鹽以及微量元素）、酸堿環(huán)境和一定的氧氣環(huán)境，絕對(duì)無菌是不存在的[2]，在我國,由于冷鏈系統(tǒng)不完善和控制措施不當(dāng)，會(huì)使肉制品中的微生物在適宜的條件下大量繁殖,使其安全和品質(zhì)不能得到有效的保證和監(jiān)控,嚴(yán)重危害人們的健康[3]。在確定相關(guān)溫度、pH、水分活度、防腐劑等環(huán)境因素下，應(yīng)用預(yù)測(cè)食品微生物學(xué)的數(shù)學(xué)模型，可以快速對(duì)重要微生物的生長(zhǎng)、存活和死亡進(jìn)行預(yù)測(cè)，從而確保食品在生產(chǎn)、運(yùn)輸、儲(chǔ)存等過程中的安全和穩(wěn)定，是一種防止病原微生物對(duì)食品污染的有效的預(yù)警工具[4]。

動(dòng)力學(xué)模型是建立有關(guān)微生物生長(zhǎng)速率和環(huán)境因素之間的數(shù)學(xué)模型[5]。Whiting和Buchanan[6]提出的模型分類系統(tǒng)將模型分為一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)模型。一級(jí)模型是依據(jù)微生物的生長(zhǎng)曲線，描述環(huán)境條件和食品成分等因素對(duì)微生物生長(zhǎng)產(chǎn)生的影響[7]。二級(jí)模型主要表達(dá)初級(jí)模型的參數(shù)（λ、μ、A等）與環(huán)境變量（溫度、pH、Aw、氣體濃度等）之間的函數(shù)關(guān)系[8]。較為常用的有響應(yīng)面方程（Response Surface Equation）、平方根模型（Square Root Model）、Arrhenius模型等。三級(jí)模型主要指建立在初級(jí)和二級(jí)模型之上的電腦應(yīng)用軟件程序[9]。通過建立微生物的一級(jí)、二級(jí)生長(zhǎng)模型，可以進(jìn)一步建立如ComBase[9]，TFI[10]，HACCP[11]等三級(jí)模型軟件，從而有效指導(dǎo)食品生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸、儲(chǔ)存等步驟條件的控制，為食品安全提供保證。

1 材料與方法

1.1 菌株

沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CMCC 1.1552（Salmonella）購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

32號(hào)瓊脂培養(yǎng)基：牛肉浸膏（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）5.0 g/L，蛋白胨（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）10.0 g/L，酵母提取物（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）5.0 g/L，葡萄糖（北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司）5.0 g/L，NaCl（北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司）5.0 g/L，瓊脂粉（日本kebio公司）15 g/L。實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)液制備：將250 g市售冷鮮豬肉用滅菌剪刀剪成小塊后，放入無菌袋，加入滅菌生理鹽水500 mL，用均質(zhì)器充分拍打、粉碎，得到的肉懸液依次通過80、40、0.45、0.22μm的無菌濾膜進(jìn)行除菌，其濾液作為后續(xù)培養(yǎng)基備用。

1.3 儀器

ZSD-1270生化培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司；HG-80高壓蒸汽滅菌鍋：HIRAYAMA MANUFACTURING CORPORATION；UW6200H電子天平、UV-1800紫外分光光度計(jì)：島津（香港）有限公司；B-212pH計(jì)：堀場(chǎng)貿(mào)易（上海）有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

培養(yǎng)基的理化性質(zhì)對(duì)微生物的生長(zhǎng)有顯著影響[12]，本實(shí)驗(yàn)使用鮮豬肉濾汁作為培養(yǎng)基，與實(shí)際豬肉中微生物生長(zhǎng)環(huán)境較為接近。將豬肉濾汁培養(yǎng)基各100 mL分裝在5個(gè)錐形瓶中，分別放在17、25、30、35和37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)熱，使溫度達(dá)到平衡。用生理鹽水將活化好的沙門氏菌進(jìn)行適當(dāng)稀釋，用移液器吸取菌液1 mL加入預(yù)熱好的豬肉濾汁培養(yǎng)基中，使接種的沙門氏菌的初始濃度小于102cfu/mL，將5個(gè)錐形瓶放置于相應(yīng)溫度的培養(yǎng)箱中。同時(shí)以未接種的豬肉濾汁培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。每隔一定時(shí)間取出錐形瓶，混勻培養(yǎng)液后，取3個(gè)1 mL培養(yǎng)液用于測(cè)定吸光度。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)代入一級(jí)模型建立生長(zhǎng)動(dòng)力模型。

1.5 模型的建立

1.5.1 一級(jí)模型

Baranyi模型[13-14]中加入了一個(gè)調(diào)整函數(shù)a（t）。a（t）取決于細(xì)胞的生理狀態(tài)和對(duì)新環(huán)境的適應(yīng)，從而可以描述微生物生長(zhǎng)的遲滯期。若前培養(yǎng)條件相同，細(xì)胞的最大生長(zhǎng)速率μm和遲滯期λ的乘積只隨著細(xì)胞的生理狀態(tài)而改變。該模型的簡(jiǎn)化形式為：

式中：t為任意時(shí)刻，h；N為t時(shí)刻的細(xì)菌數(shù)，（cfu/mL）；N0為初始菌數(shù)，（cfu/mL）；μm為最大生長(zhǎng)速率，[（log cfu/（mL·h）]；λ為遲滯期，h。

同時(shí)應(yīng)用經(jīng)典的Logistic模型對(duì)生長(zhǎng)曲線進(jìn)行曲線擬合分析，與Baranyi模型進(jìn)行比較。Logistic模型表達(dá)式為：

式中：A1，A2，x0，p為參數(shù)。

1.5.2 二級(jí)模型

Ratkowsky等[15-16]根據(jù)微生物在不同溫度條件下，生長(zhǎng)速率或遲滯期倒數(shù)之間存在線性關(guān)系，提出一個(gè)經(jīng)典的二級(jí)模型[17]：

式中：T為建模溫度，℃；TMIN，μ和TMIN，λ分別為對(duì)應(yīng)于μm和λ的細(xì)菌最小生長(zhǎng)溫度，℃；a，b為模型常數(shù)。

實(shí)驗(yàn)中，Baranyi模型用DMfit veraion2.0軟件來擬合,Logistic模型用Origin8.0軟件來擬合，Ratkowsky模型使用Microsoft Excel 2007軟件擬合。

1.6 模型的檢驗(yàn)

將計(jì)算得到的各溫度下沙門氏菌在鮮豬肉濾汁中的生長(zhǎng)速率，與Ratkowsky二級(jí)模型的預(yù)測(cè)值相比較。繪制殘差圖，按（4）和（5）計(jì)算偏差因子（bias factor）與準(zhǔn)確因子（accuracy factor），同時(shí)繪制預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值對(duì)比圖，對(duì)模型進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙門氏菌一級(jí)生長(zhǎng)模型的建立

使用Baranyi模型對(duì)沙門氏菌在17、25、30、35、37 ℃的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行擬合，DMfit軟件同時(shí)還計(jì)算出了沙門氏菌生長(zhǎng)模型的2個(gè)變量生長(zhǎng)速率（μm）和遲滯期（λ），以及擬合曲線的相關(guān)系數(shù)（r2）和標(biāo)準(zhǔn)誤差（SE），如表1所示。

表 1 Baranyi模型參數(shù)及統(tǒng)計(jì)分析Table 1 Statistic analysis of growth parameters of Baranyi&Robert model

使用Logistic模型對(duì)沙門氏菌在17、25、30、35、37 ℃的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行擬合，由Origin8.0軟件計(jì)算出擬合方程中的系數(shù)，如表2所示。

表 2 Logistic模型參數(shù)及統(tǒng)計(jì)分析Table 2 Statistic analysis of growth parameters of Logistic model

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在本實(shí)驗(yàn)條件下，使用Baranyi模型與Logistic模型擬合，均能得到較高的相關(guān)系數(shù)（R2≥0.97），選擇Baranyi模型得出的參數(shù)進(jìn)一步建立二級(jí)模型。

2.2 沙門氏菌二級(jí)生長(zhǎng)模型的建立

將不同溫度下Baranyi模型擬合得出的最大生長(zhǎng)速率μm代入Ratkowsky方程擬合，即得到最大生長(zhǎng)速率-溫度的二級(jí)模型，擬合曲線見圖1。

得到的擬合方程為：

式中，T（溫度）、μm（最大生長(zhǎng)速率）的單位分別為℃、[log cfu/（mL·h）]。

從圖1中可以看出，溫度在5℃～37℃范圍內(nèi)沙門氏菌的比生長(zhǎng)速率的平方根與溫度呈線性關(guān)系，并且生長(zhǎng)速率隨著溫度的升高而增加，擬合方程的相關(guān)系數(shù)（r2）達(dá)到了0.9429。

2.3 模型的檢驗(yàn)

對(duì)沙門氏菌生長(zhǎng)速率模型的準(zhǔn)確性在實(shí)驗(yàn)室條件下用以下3種方法進(jìn)行了檢驗(yàn)。

2.3.1 殘差檢驗(yàn)

從圖2可知，沙門氏菌生長(zhǎng)速率平方根的殘差均在±0.05范圍內(nèi)，因此可以認(rèn)為該模型在α=0.05水平上是可信的。

2.3.2 準(zhǔn)確因子與偏差因子檢驗(yàn)

用國際上通用的2個(gè)指標(biāo)偏差因子和準(zhǔn)確因子對(duì)本實(shí)驗(yàn)所得預(yù)測(cè)模型進(jìn)行了檢驗(yàn)。偏差因子是衡量預(yù)測(cè)值是否高過或低于實(shí)測(cè)值，該值小于1表明生長(zhǎng)速率值比實(shí)測(cè)值大，預(yù)測(cè)值較為安全；大于1表示生長(zhǎng)速率預(yù)測(cè)值比實(shí)測(cè)值小。準(zhǔn)確因子表示預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，該值等于1表明預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值完全吻合。本實(shí)驗(yàn)建立的模型經(jīng)檢驗(yàn)，準(zhǔn)確因子為1.0464，偏差因子為0.9933，說明預(yù)測(cè)結(jié)果較為準(zhǔn)確，該模型可以被接受。

2.3.3 實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值對(duì)比

通過沙門氏菌生長(zhǎng)的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值進(jìn)行對(duì)比，來檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性，結(jié)果如圖3所示。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以新鮮豬肉濾汁為培養(yǎng)液，接種沙門氏菌，應(yīng)用Baranyi模型和Logistic模型擬合了沙門氏菌一級(jí)模型生長(zhǎng)曲線，得出其在17、25、30、35、37 ℃均有較高的相關(guān)系數(shù)（R2≥0.97）。將Baranyi模型計(jì)算得到的最大生長(zhǎng)速率數(shù)據(jù)，帶入Ratkowsky方程擬合得到溫度-最大生長(zhǎng)速率的二級(jí)模型,擬合方程的相關(guān)系數(shù)（r2）達(dá)到了0.9429。通過繪制殘差圖、準(zhǔn)確因子、偏差因子以及觀測(cè)值與實(shí)測(cè)值對(duì)比圖進(jìn)行模型檢驗(yàn)。結(jié)果殘差在±0.05之間，準(zhǔn)確因子為1.0464，偏差因子為0.9933，預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值比較接近。

傳統(tǒng)的一級(jí)模型建立，常使用商品化的培養(yǎng)基或直接使用豬肉切片作為培養(yǎng)基。然而，商品化的培養(yǎng)基其化學(xué)組成與實(shí)際豬肉有一定差距；直接使用豬肉切片，由于存在天然菌群的干擾，導(dǎo)致不同豬肉樣品間存在較大差異，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較低。本文使用鮮豬肉濾汁作為培養(yǎng)基，與商品化培養(yǎng)基相比較，其成分更接近真實(shí)豬肉，同時(shí)濾汁經(jīng)過過濾除菌，有效地控制了實(shí)驗(yàn)中的變量，簡(jiǎn)化了模型設(shè)計(jì)。

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Predictive Models for Salmonella Growth in Fresh Pork

GAO Li－juan1，2，WENG Shao－su1，LIU Qing－jun1，ZHANG Jing－h(huán)ua1，CHEN Er－ning1，BAI Yu1，HAN Bei－zhong2，*
（1.Beijing Centre for Physical and Chemical Analysis，Beijing 100089，China；2.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

Pork filtration，as a growth medium，was inoculated with Salmonella spp.to develop the growth curve of Salmonella at 17，25，30，35，37 ℃，respectively.Primary models were developed based on Baranyi model and Logistic model，respectively.The secondary model was developed based on the Ratkowsky model for the effect of different temperatures on the maximum growth rate.The secondary model was validated through residual plots，bias factor，accuracy factor，and plot of predictive versus observed data.The result of the validation indicated that the residual was±0.05，the bias factor and the accuracy factor was 1.0464 and 0.9933，respectively，and the predictive data was close to the observed data.

Salmonella；growth model；pork；Logistic model；Baranyi model；Ratkowsky model

北京市科技新星計(jì)劃資助項(xiàng)目（2008B31）

高麗娟（1978—），女（漢），副研究員，博士，研究方向：應(yīng)用微生物學(xué)。

*通信作者：韓北忠（1961—），男，教授，博士，研究方向：食品微生物學(xué)。

2011-07-01