楊建遠(yuǎn)，周筱玲，王萍蘭，袁志平，許文權(quán)，李月平

（九江學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江西 九江 332000）

響應(yīng)曲面法優(yōu)化廬山樓梯草多糖的提取工藝

楊建遠(yuǎn)，周筱玲，王萍蘭，袁志平，許文權(quán)，李月平

（九江學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江西 九江 332000）

為優(yōu)化廬山樓梯草多糖的提取工藝，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取提取溫度、提取時(shí)間以及液料比為自變量，多糖提取率為響應(yīng)值，采用中心組合設(shè)計(jì)的方法，研究各自變量及其交互作用對(duì)多糖提取率的影響。利用響應(yīng)面分析方法，模擬得到二次多項(xiàng)式回歸方程的預(yù)測(cè)模型，并確定廬山樓梯草多糖提取工藝的最佳條件為提取溫度96℃、提取時(shí)間4.4 h、液料比42∶1（mL/g）、提取1次時(shí)，多糖提取率達(dá)到最大值。該條件下多糖提取率預(yù)測(cè)值為13.86%，驗(yàn)證值為14.06%。

廬山樓梯草；多糖；提取工藝；響應(yīng)曲面法

多糖是組成生物有機(jī)體的一類重要生物大分子，作為信息分子廣泛參與細(xì)胞間配體與受體的相互識(shí)別、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過(guò)程，與細(xì)胞活化、增殖、分化及產(chǎn)生細(xì)胞因子等有關(guān)[1]。普遍存在于高等植物、細(xì)菌、真菌、藻類和動(dòng)物體內(nèi)。絕大多數(shù)多糖不僅對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒副作用，而且能夠提高機(jī)體的免疫功能，具有抗病毒、抗輻射、抗癌、降血糖、減肥和清除氧化自由基的作用[2]。因此。多糖的研究引起人們的高度重視并具有十分重要的意義。

廬山樓梯草（Elatostema stewardii Merr.）為蕁麻科樓梯草屬植物，別名接骨草、白龍骨、冷坑青、冷坑蘭（浙江）、蜈蚣七（湖北）、枵棗七（陜西）。江西北部、湖南西北部、湖北南部、福建北部、浙江西北部、安徽南部、四川東部、陜西南部、河南東部均有野生分布。廬山樓梯草全草入藥，可以活血、散淤、消腫、解毒；根可治骨折；莖葉可治咳嗽[3]。

對(duì)廬山樓梯草多糖成分的研究，國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。為此，本研究選取液料比、提取時(shí)間、提取溫度3個(gè)因素，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法對(duì)廬山樓梯草多糖水浸提工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為廬山樓梯草多糖的生物學(xué)活性研究與應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

廬山樓梯草莖葉：采自江西九江廬山好漢波；石油醚、硫酸、蒽酮、無(wú)水葡萄糖等：分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

四兩裝高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：QE-200克 屹立；HG101-5型電熱鼓風(fēng)干燥箱：南京實(shí)驗(yàn)儀廠；ZXZ-1型旋片真空泵：臨海市譚氏真空設(shè)備有限公司；HH-w600數(shù)顯三用恒溫水箱：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；BS 224 S電子天平：塞多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；TDL-40B型臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；SP-1900UV系列紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；RE-85Z旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鞏義市英峪予華儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 廬山樓梯草多糖提取工藝

廬山樓梯草→預(yù)處理→自然風(fēng)干→粉碎→過(guò)篩→烘干→準(zhǔn)確稱量→石油醚浸泡→熱水浸提→離心→上清液定容→測(cè)定多糖含量

1.3.2 提取方法

取過(guò)60目篩的烘干廬山樓梯草粉末200 g置圓底燒瓶中，加石油醚500 mL，浸泡12 h脫脂，去色，抽濾、風(fēng)干后，準(zhǔn)確稱量2.50 g，置錐形瓶中，加蒸餾水至一定體積，熱水提取，離心，合并上清液，定容至200 mL，再取1 mL定容于25 mL容量瓶中待測(cè)。

1.3.3 廬山樓梯草多糖含量測(cè)定

[4]略有改動(dòng)。

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取105℃干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，置于100 mL容量瓶中，以蒸餾水定容至刻度，配成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。分別精確吸取標(biāo)準(zhǔn)液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.2、1.6 mL置具塞試管中，補(bǔ)水至2 mL，加入0.2%硫酸-蒽酮試液4 mL，搖勻，立即冰水水浴，全部加好后置于沸水浴加熱10 min，取出用冷水冷卻至室溫暗處放置10 min，以0為空白對(duì)照，于625 nm處測(cè)定吸光度。以吸收度A為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為:y=10.892x-0.0121，其中R2=0.9981，線性范圍0～0.1mg/mL。

1.3.3.2 樣品中多糖含量測(cè)定

準(zhǔn)確吸取樣品待測(cè)液1 mL，補(bǔ)水至2 mL，按照1.3.3.1 的方法測(cè)定吸光度（A），由回歸方程計(jì)算樣品液中粗多糖含量（C）。

1.3.4 多糖提取率的計(jì)算

式中：A為吸光度；V為被測(cè)液總共稀釋的體積倍數(shù)；M為廬山樓梯草干粉重量，mg。

1.3.5 廬山樓梯草多糖水提工藝的優(yōu)化

首先分別考察液料比、提取時(shí)間、提取溫度和提取次數(shù)對(duì)廬山樓梯草多糖得率的影響，單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1；在單因素的基礎(chǔ)上，再選擇3個(gè)主要因素進(jìn)行響應(yīng)曲面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，確定廬山樓梯草多糖提取的最佳工藝條件。

表 1 廬山樓梯草多糖提取單因素試驗(yàn)Table 1 Univariate experiments for extracting polysaccharides from Elatostema stewardii Merr

2 結(jié)果與分析

2.1 水浸提過(guò)程中單因素對(duì)多糖提取率的影響

2.1.1 液料比對(duì)多糖提取率的影響

不同液料比下多糖提取率，見(jiàn)圖1。

由圖1可知，多糖提取率隨液料比的增大而呈上升趨勢(shì)，這是因?yàn)榧铀吭酱髣t提取出來(lái)的多糖越容易溶解，損失就越少，但液料比到達(dá)40∶1（mL/g）時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，隨后隨著液料比的繼續(xù)增加，提取率不再增加，稍呈下降趨勢(shì)。單因素試驗(yàn)的結(jié)果顯示，液料比應(yīng)在40∶1（mL/g）左右。

2.1.2 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響

不同溫度下多糖提取率，見(jiàn)圖2。

由圖2可知，隨著溫度的升高，多糖的提取率逐漸增加。當(dāng)高于90℃時(shí)，提取率有所下降?？赡苁前殡S溫度的升高，原料溶脹度增大，傳質(zhì)強(qiáng)化，從而使得多糖的溶出率增加的緣故，溫度增至100℃時(shí)水分蒸發(fā)較多等原因，故反而有所下降。故選擇提取溫度為90℃左右。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

不同提取時(shí)間下多糖提取率，見(jiàn)圖3。

由圖3可知，多糖提取率隨著提取時(shí)間的增長(zhǎng)，呈現(xiàn)先上升再下降的總體趨勢(shì)，在4 h附近出現(xiàn)最大值。故選擇提取時(shí)間為4 h左右。

2.1.4 提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響

不同提取次數(shù)下多糖提取率，見(jiàn)圖4。

由圖4可知，經(jīng)過(guò)1次提取，大部分多糖都可以被提取出來(lái)，所以為了簡(jiǎn)化工藝、節(jié)約能源，節(jié)省時(shí)間，本試驗(yàn)選擇提取1次。

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化廬山樓梯草多糖提取工藝條件

根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)所得結(jié)果，確定提取次數(shù)為1次，選取提取溫度、液料比、提取時(shí)間3個(gè)對(duì)多糖提取率影響顯著的因素，分別以A、B和C為代表，每一個(gè)自變量的低、中、高試驗(yàn)水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼。以多糖提取率（Y）為響應(yīng)值，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，確定廬山樓梯草多糖的最佳提取工藝。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3，采用軟件Design-Expert 8.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表 2 響應(yīng)面分析因素與水平Table 2 Variables and levels in response surface design

表 3 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table 3 Process variables and levels in response surface design arrangement and experimental response values

表 4 回歸分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance for quadric regression model

由表4模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)可知，提取溫度的一次項(xiàng)呈極顯著水平，提取溫度、液料比、提取時(shí)間的二次項(xiàng)呈極顯著水平（P<0.01）。由F值可知，各因素對(duì)多糖提取率的影響次序：溫度一次項(xiàng)>溫度二次項(xiàng)>液料比二次項(xiàng)>時(shí)間二次項(xiàng)。此外，從方差分析結(jié)果可知，R2=0.9627，表明該模型與實(shí)際擬合較好。

對(duì)表3實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，得各因子與多糖得率（Y）響應(yīng)值的二次多項(xiàng)回歸模型為：Y=13.45+1.20A+0.21B+0.28C-9.181E-0.03AB+0.39AC+0.30BC-1.20A2-0.87B2-0.74C2

響應(yīng)曲面圖可直觀地反映出各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。Design-Expert 8.0軟件處理得響應(yīng)面分析結(jié)果圖見(jiàn)5～圖7。

通過(guò)軟件分析，得水浸提廬山樓梯草粗多糖的最佳工藝條件為溫度95.6℃，液料比為41.84∶1，提取時(shí)間為4.37 h，在此條件下，單次提取理論預(yù)測(cè)值為13.86%。但考慮到實(shí)際情況將最佳提取工藝條件修正為溫度96 ℃、液料比42∶1（mL/g）、時(shí)間4.4 h。在此修正條件下，精密稱取3份樣品進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果樣品粗多糖的提取率分別為13.76%，14.14%，14.37%，平均值為14.06%，與理論預(yù)測(cè)值高0.20%。因此，采用RSM法優(yōu)化得到的提取工藝條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用響應(yīng)曲面法的Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)廬山樓梯草多糖的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，方差分析表明擬合較好。優(yōu)化后的提取工藝條件為提取溫度96℃、液料比42∶1（mL/g）、時(shí)間4.4 h。在此條件下提取1次，廬山樓梯草多糖實(shí)際提取率達(dá)14.06%。為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用廬山樓梯草多糖提供了理論參考。

參考文獻(xiàn)：

[1]CHEN Hui-li,LI Mao-shen,ZHU Yun-song.Structure and function of bio-molecule[M].Shanghai:Shanghai Medical University Press,1999:331

[2]孟慶勇,劉志輝,徐美奕，等.半葉馬尾藻多糖的提取和分析[J].光譜學(xué)與光譜分析,2004,24(12):1560-1562

[3]徐耀東,童志剛,敖小朋.園林地被植物新秀——廬山樓梯草[J].現(xiàn)代園藝,2009(1):11

[4]史俊友,索有瑞,李國(guó)梁，等.大葉白麻葉多糖提取及組分分析[J].中成藥,2010，32(1):102-106

Optimization of Extraction Process of Polysaccharides from Elatostema stewardii Merr by Response Surface Methodology

YANG Jian－yuan，ZHOU Xiao－ling，WANG Ping－lan，YUAN Zhi－pin，XU Wen－quan，LI Yue－ping
（College of Life Sciences，Jiujiang University，Jiujiang 332000，Jiangxi，China）

To optimize extraction process of polysaccharides from Elatostema stewardii Merr.According to single－factor experiments，effects of extraction temperature，extraction time and ratio of water to material as well as their interactions on yield of the polysaccharides were studied by central composite design.The predictive polynomial quadratic equations model was developed by response surface analysis.The optimum extraction conditions of the polysaccharides from Elatostema stewardii Merr were obtained as follows：extraction temperature 96 ℃，extraction time 4.4 h and liquid/solid ratio 42∶1（mL/g），which led to estimated and observed values of maximal yield of polysaccharides of 13.86%and 14.06%，respectively.

Elatostema stewardii Merr；polysaccharides；extraction technology；response surface methodology

楊建遠(yuǎn)（1979—），男（漢），講師，碩士，主要從事功能食品及天然產(chǎn)物的研究。

2011-07-03