陳婭嬌

（蒙牛（乳業(yè)）股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000）

隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，耐藥菌株逐年增多，目前金黃色葡萄球菌對(duì)青霉素G的耐藥菌株高達(dá)90%以上，尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphyrlococcus aureus，MRSA）已經(jīng)成為醫(yī)院內(nèi)感染最常見(jiàn)的致病菌[1-4]。有些細(xì)菌甚至產(chǎn)生多重耐藥，如致病性大腸埃希菌約40%的菌株對(duì)鏈霉素、氯霉素、四環(huán)素等多種抗生素產(chǎn)生耐藥性；銅綠假單胞菌對(duì)許多抗生素具有天然或獲得耐藥性，這給臨床治療帶來(lái)極大的困難，如何有效防治細(xì)菌感染及控制細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生與播散是一項(xiàng)長(zhǎng)期、復(fù)雜、艱巨的任務(wù)，因而尋找和研制有效的抗菌藥物非常必要。抗菌肽（antibacterial peptide，ABP）是生物體天然免疫防御的重要組成部分，多數(shù)是一類(lèi)相對(duì)分子量小于10 ku，由20～60個(gè)氨基酸殘基組成[5-7]。鏈長(zhǎng)、序列及結(jié)構(gòu)是多樣性的陽(yáng)離子型兩親性肽類(lèi)。這類(lèi)活性多肽多數(shù)具有強(qiáng)堿性、熱穩(wěn)定性以及廣譜抗菌等特點(diǎn)?？咕牡闹苽浞椒ㄖ饕腥缦?種:從動(dòng)植物組織中直接提取法、化學(xué)合成法、基因工程法和酶解法。由于酶作用本身的特點(diǎn)和固定化酶技術(shù)的應(yīng)用,酶解法具有成本低、安全性好、對(duì)設(shè)備條件要求不高、便于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn),因而B(niǎo)olscher等認(rèn)為酶解蛋白質(zhì)可能是大批量生產(chǎn)抗菌肽最有前途的方法。鑒于胰蛋白酶水解牛乳后產(chǎn)物中的抗菌肽具有高抗菌性,對(duì)G-、G+菌均有抑菌作用,且MIC值與乳酸鏈球菌肽（nisin）的抑菌作用相當(dāng)，為獲得具有廣譜抗菌活性的抗菌肽，本實(shí)驗(yàn)以大腸桿菌（escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（staphy－lococcus aureus）、產(chǎn)氣芽孢桿菌（aer osis germ bacillus）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、黑曲霉（aflatoxicosis）為實(shí)驗(yàn)菌，在預(yù)備實(shí)驗(yàn)確定的胰蛋白酶水解條件下研究了乳源抗菌肽抑菌活性的影響[8-11]。本文采用瓊脂擴(kuò)散法和試管連續(xù)稀釋法進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)及最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定，以探討乳源抗菌肽對(duì)常見(jiàn)致病菌和條件致病菌的體外抗菌活性。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

菌株來(lái)源為金黃色葡萄球菌（ATCC25923），乙型溶血性鏈球菌（ATCC25921），大腸埃希菌（ATCC25922），福氏志賀氏菌（ATCC27891）：由湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院提供。乳源抗菌肽液：由湖北工業(yè)大學(xué)膜技術(shù)研究所提供；乙醇，DPPH溶液，PBS溶液，硫酸亞鐵，三氯醋酸，亞硝酸鈉，硝酸鋁，均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 乳源抗菌肽的制備

將脫脂奶粉配成10%的溶液，調(diào)節(jié)pH至8.0，按酶與底物之比為0.025的比例加入胰蛋白酶，在37℃恒溫水浴，酶解15 min，然后用沸水浴滅酶活5 min，離心（10000 r/min）15 min，收集上清液。將所得上清液用小型超濾系統(tǒng)進(jìn)行分離，取5 ku～10 ku的肽段經(jīng)冷凍真空干燥備用[12]。

1.2.2 菌液的制備

將金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、大腸埃希菌、福氏志賀氏菌接種于普通瓊脂平板上，置37℃溫箱中培養(yǎng)18 h，用無(wú)菌生理鹽水配成每毫升相當(dāng)于3億的菌濃度（金黃色葡萄球菌配成每毫升相當(dāng)于9億的菌濃度[13]。

1.2.3 瓊脂擴(kuò)散法

用無(wú)菌棉簽沾取菌液在普通瓊脂平板上作均勻密集劃線，待菌液干燥后，用外徑5 mm的打孔器打孔，每孔加藥液200 μL，平放在37℃溫箱中培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果，測(cè)量抑菌圈直徑。抑菌圈直徑取兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值[14]。

1.2.4 試管連續(xù)稀釋法

根據(jù)抑菌實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，測(cè)定乳源抗菌肽溶液對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度。取小號(hào)試管6支，編號(hào)。第一步每支管各加1 mL肉湯培養(yǎng)基。然后在第1管加1 mL藥液，用吸管在第1管吹吸數(shù)次，使藥液與肉湯培養(yǎng)基混勻，取出1 mL加于第2管，混勻取出1 mL加于第3管，如此稀釋至第5管棄去1 mL，第6管不加藥液作為對(duì)照。第三步每管加菌液50 μL，混勻，置37℃溫箱中培養(yǎng)24 h。然后從每管中取出一接種環(huán)接種于普通瓊脂平板上，再繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。以無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最高稀釋濃度為該藥液的最低抑菌濃度。

1.3 抑菌方法

1.3.1 混合菌液的制備

將金黃色葡萄球菌，乙型溶血性鏈球菌，大腸埃希菌，福氏志賀氏菌混合在一起,然后稀釋配制成10個(gè)/mL的菌懸液，菌液按0.2 mL/平板（平板直徑為60.0 mm）的量均勻涂于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，再貼上無(wú)菌圓形濾紙（直徑為6.0 mm），在各紙片上分別滴加20 L抗菌肽溶液，4℃靜置3 h，37℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌圈直徑。

1.3.2 單一性菌種溶液的制備

將金黃色葡萄球菌，乙型溶血性鏈球菌，大腸埃希菌，福氏志賀氏菌分別配制成10個(gè)/mL的菌懸液，菌液按0.2 mL/平板（平板直徑為60.0 mm）的量均勻涂于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，再貼上無(wú)菌圓形濾紙（直徑為6.0 mm），在各紙片上分別滴加20 L抗菌肽溶液，4℃靜置3 h，37℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌圈直徑。

1.4 測(cè)定乳源抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、大腸埃希菌、福氏志賀氏菌的最小抑菌濃度

配制濃度P分別為0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125μg/mL的乳源抗菌肽溶液，按1.3的方法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，取抑菌圈最小時(shí)的濃度為最小抑菌濃度。

2 抑菌性研究結(jié)果

配制不同濃度的乳源抗菌肽溶液，其抑菌圈大小與濃度的關(guān)系如圖1所示。

圖1 乳源抗菌肽的濃度和抑菌圈直徑的對(duì)應(yīng)關(guān)系Fig.1 Milk-derived antimicrobial peptide concentration and the corresponding relationship between inhibition zone diameter

配制不同濃度的乳源抗菌肽溶液，鋪于培養(yǎng)皿上，菌落數(shù)與乳源抗菌肽溶液濃度關(guān)系如表1和表2所示。

表1 乳源抗菌肽對(duì)混合菌液的抑制情況Table 1 Milk-derived antimicrobial peptides in the inhibition of the mixed bacterial suspension

表2 乳源抗菌肽對(duì)單獨(dú)菌種溶液的抑制情況Table 2 Milk-derived antimicrobial peptides on the inhibition of a single bacterium

3 結(jié)論

1）乳源抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為0.125μg/mL，對(duì)乙型溶血性鏈球菌、大腸埃希菌、福氏志賀氏菌的最小抑菌濃度為0.25μg/mL；當(dāng)乳源抗菌肽的濃度為0.5μg/mL時(shí),對(duì)金黃色葡萄球菌，乙型溶血性鏈球菌，大腸埃希菌，福氏志賀氏菌混合在一起的濃度為10個(gè)/mL的菌溶液有很好的抑菌效果。

2）實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乳源抗菌肽提取物對(duì)金黃色葡萄球菌，乙型溶血性鏈球菌，大腸埃希菌，福氏志賀氏菌有明顯的抗菌活性，但對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌活性強(qiáng)于大腸埃希菌，這可能是乳源抗菌肽的有效成分對(duì)不同病原菌的作用機(jī)理不同所致。由于乳源抗菌肽粗提物中含有多種化學(xué)成分，成分與藥理作用復(fù)雜，并且受多種因素的影響，本文只做了乳源抗菌肽的粗提液，有關(guān)乳源抗菌肽有效成分的提取與分析有待進(jìn)一步研究。

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