崔艷，呂文，龐紅勛，劉金福

（1.天津農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)系，天津 300384；2.中法合營(yíng)王朝葡萄釀酒有限公司，天津 300402）

葡萄酒是采用新鮮葡萄或葡萄汁經(jīng)完全或部分酒精發(fā)酵而得到的飲料。通過釀酒酵母（Saccharomsyces cerevisiae）的酒精發(fā)酵和自溶，產(chǎn)生了如甘油、醋酸、琥珀酸、丙酮酸、酯類物質(zhì)、蛋白質(zhì)和多糖類物質(zhì)，這些物質(zhì)的產(chǎn)生對(duì)葡萄酒的酒體、顏色、香氣和風(fēng)味，乃至葡萄酒整體質(zhì)量都具有重要的影響，因此具有優(yōu)良性狀酵母的選育非常重要。

隨著科技手段的提高和分子生物學(xué)研究的深入發(fā)展，葡萄酒釀酒酵母的選育已經(jīng)不再局限于只考慮釀酒酵母菌自身特點(diǎn)，人們的適飲性需求、釀造工藝、地域特點(diǎn),風(fēng)土環(huán)境對(duì)菌種的影響及其協(xié)同作用、以及基因工程菌的構(gòu)建也越來(lái)越多地成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。另外本土化特色酵母菌的選育也越來(lái)越成為釀造風(fēng)格獨(dú)特的葡萄酒的熱點(diǎn)。本文就近年來(lái)國(guó)內(nèi)外葡萄釀酒酵母選育技術(shù)的進(jìn)展進(jìn)行綜述,為我國(guó)本土化酵母菌的實(shí)際應(yīng)用提供參考。

1 釀酒酵母菌研究的基礎(chǔ)和主要考慮因素

自1997年完成了釀酒酵母菌全基因組的序列測(cè)定后，科學(xué)家們相繼建立了釀酒酵母基因組數(shù)據(jù)庫(kù)和酵母蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)，其中容納了有關(guān)酵母菌的基因和其蛋白質(zhì)功能、結(jié)構(gòu)和相互間關(guān)系等大量信息，再加上近年來(lái)DNA微矩陣分析的發(fā)展，為原子和分子水平的酵母特性研究、優(yōu)良表型特征基因的鑒定和酵母菌的基因工程構(gòu)建打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

在葡萄酒用酵母菌的選育中，有兩類因素影響著研究的方向和出發(fā)點(diǎn)。一類是較復(fù)雜的影響葡萄酒質(zhì)量的因素，包括一類，二類香氣物質(zhì)和其他感官特性的因素，另一類是出于工藝考慮：如耐受性（例如糖，SO2，酒精含量、抗真菌素，低溫和高溫等）、嗜殺型、化學(xué)穩(wěn)定性、生長(zhǎng)模式等工藝因素。表1和表2列出了當(dāng)前選育釀酒酵母的主要參考因素。

2 國(guó)內(nèi)外葡萄酒酵母選育和改良方法的進(jìn)展和利弊

從1960年開始，一些微生物育種方法產(chǎn)生并得到了發(fā)展和應(yīng)用，自然選育，誘變、雜交育種，原生質(zhì)體融合,基因工程育種都是當(dāng)前最普遍的育種手段，而且各有利弊，在菌種的選育時(shí)，一定要立足出發(fā)點(diǎn)，將不同的育種方法配合使用，才能夠真正篩選出優(yōu)良的酵母菌。

表1 酵母菌選育的主要參考工藝因素Table 1 The main technique factors in wine selection

表2 酵母菌選育的主要參考質(zhì)量因素Table 2 The main quality factors in wine yeast selection

2.1 自然選育

自然選育即不經(jīng)人工處理，利用微生物的自然突變進(jìn)行菌種選育的過程。自然突變被認(rèn)為是由多因素低劑量的誘變效應(yīng)引起的，這樣的突變可使野生的酵母菌天然具有某種較突出的特性。眾所周知，老世界葡萄酒產(chǎn)國(guó)通過野生酵母自然發(fā)酵的葡萄酒無(wú)論在復(fù)雜感、結(jié)構(gòu)、香氣、地域特色方面都是其他地區(qū)無(wú)法比擬的。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)在它們的葡萄園中篩出的假絲酵母（Candida）、克勒克酵母（Kloeckera）、有孢漢遜酵母（Hanseniasporacan）可通過代謝和自溶提高葡萄酒的香氣，參與復(fù)雜新鮮的風(fēng)味物質(zhì)的形成[1]?，F(xiàn)在，許多國(guó)外的酵母生產(chǎn)廠家利用自然選育的方法生產(chǎn)純種的釀酒酵母產(chǎn)品，這類商用葡萄酒酵母已在許多新世界葡萄酒生產(chǎn)國(guó)（澳大利亞，美國(guó)，南非，智利、中國(guó)等）的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。使用這類商用酵母優(yōu)點(diǎn)是易于管理，保障了發(fā)酵的順利進(jìn)行；缺點(diǎn)是使新世界的葡萄酒酒體較單調(diào)、缺乏個(gè)性和特點(diǎn)，相同或相近產(chǎn)區(qū)的葡萄酒風(fēng)味趨于同質(zhì)化。因此國(guó)外的科研人員近年來(lái)逐步開展了自然選育具有特殊功能酵母菌的研究，希望通過這類酵母菌的使用，彌補(bǔ)葡萄原料品質(zhì)的不足，或滿足特殊生產(chǎn)工藝的要求。例如有人從Parmesan干酪乳清中篩出的釀酒酵母具有降低葡萄酒中蘋果酸的作用，最高降幅可達(dá)50%[2]，這類酵母適用于冷涼產(chǎn)區(qū)酸度較高的葡萄原料的發(fā)酵，有利于降低葡萄酒過強(qiáng)的酸感。還有人從葡萄酒生產(chǎn)中篩出的酵母菌（Saccharomyces uvarum）在低溫下（6℃～10℃）具有較強(qiáng)的發(fā)酵力，可用來(lái)發(fā)酵冷藏的葡萄汁，其最主要的特點(diǎn)是能夠合成蘋果酸，可以改善炎熱產(chǎn)區(qū)葡萄原料酸度不夠的問題；同時(shí)它能產(chǎn)少量的醋酸和大量的甘油和琥珀酸,對(duì)于改善葡萄酒的香氣也有重要的影響[3]。有科學(xué)家已篩選出在發(fā)酵過程中不積累尿素的酵母，對(duì)降低葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量具有積極的意義[4]。2009年在新西蘭Kumeu River葡萄酒廠發(fā)現(xiàn)了近100種獨(dú)特的酵母菌株，包含6種不同形態(tài)，之間并未雜交繁殖，且與商用菌株毫無(wú)關(guān)聯(lián)，這些酵母或許會(huì)成為揭示新西蘭葡萄酒風(fēng)味特性的有效工具[5]。

由于酵母菌株自發(fā)突變幾率很低，只靠從群體中篩選出個(gè)別有價(jià)值的優(yōu)良突變體的機(jī)會(huì)相對(duì)較少，因此從自然界直接篩選的野生酵母，較難具有葡萄酒所要求的復(fù)雜的理想特性，有時(shí)需進(jìn)一步的人工干預(yù)，才能達(dá)到目的。然而，近年來(lái)為了獲得安全的、具有地域風(fēng)格的菌株，很多的葡萄酒國(guó)家重新開始重視自然選育。

2.2 誘變育種

誘變育種即利用物理或化學(xué)的方法處理均勻分散的微生物群體，使其基因突變頻率大幅度提高，從中挑選少數(shù)符合目的的突變菌株以供使用的育種方法。國(guó)外科研人員對(duì)二次發(fā)酵香檳酒的釀酒酵母進(jìn)行誘變，通過改善其自溶特性縮短酵母多糖和甘露糖蛋白等物質(zhì)的溶出時(shí)間，可使瓶?jī)?nèi)二次發(fā)酵香檳酒的瓶?jī)?chǔ)期縮短3～6個(gè)月，達(dá)到縮短陳釀期的目的[6]。還有人通過該法改善了釀酒酵母對(duì)氮源的利用方式，解除了氨基酸利用途徑的阻遏作用，同時(shí)提高了發(fā)酵速率，縮短了發(fā)酵時(shí)間[7]。我國(guó)的科研人員發(fā)現(xiàn)紅外CO2激光輻照誘變可使菌株產(chǎn)乙醇能力有較大的變化[8]，甲磺酸乙酯（EMS）誘變可篩出低產(chǎn)H2S和高產(chǎn)谷胱甘肽（GSH）的突變株[9]。

盡管誘變育種簡(jiǎn)單易行，但研究發(fā)現(xiàn)酵母菌的基因結(jié)構(gòu)使得這種育種方法應(yīng)用起來(lái)有局限性，因?yàn)榇蟛糠值慕湍富蚨加?個(gè)以上的拷貝，因此選擇隱性突變是很困難的，而且長(zhǎng)期使用誘變劑會(huì)導(dǎo)致菌種疲勞，遺傳很不穩(wěn)定。

2.3 雜交育種

雜交育種是利用酵母在營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)的有性繁殖、不同遺傳特性和相反交配型的細(xì)胞產(chǎn)生雙倍體等特點(diǎn)進(jìn)行育種的方法。雜交育種的目的一般是為了使菌種性狀滿足釀造工藝的特殊要求。比較典型的例子是國(guó)外運(yùn)用這種技術(shù)成功地將一個(gè)嗜殺酵母的單倍體和一個(gè)耐SO2的單倍體進(jìn)行雜交，所獲得的新酵母菌增強(qiáng)了耐SO2能力，提高了抵御雜菌污染的能力和發(fā)酵效率[10]。由于我國(guó)葡萄產(chǎn)區(qū)大多在采收季節(jié)前后降雨量較多，較高的環(huán)境濕度使葡萄易被有害微生物侵染，具有嗜殺特性和耐SO2能力的酵母對(duì)于葡萄質(zhì)量不佳的產(chǎn)區(qū)具有較好的發(fā)酵效果。國(guó)外在葡萄酒酵母雜交育種方面已做了許多科學(xué)研究，有人將篩自乳清的釀酒酵母與葡萄汁酵母雜交，其雜合子具有更強(qiáng)的降解蘋果酸能力和較低的產(chǎn)乙酸能力[11]，這項(xiàng)研究對(duì)選育紅葡萄酒酵母具有指導(dǎo)作用。有人將一種絮凝的酵母菌和一種不產(chǎn)H2S的酵母菌進(jìn)行了雜交用于起泡葡萄酒的發(fā)酵[12]，新菌種有利于發(fā)酵后排除酒泥、提高酒體澄清度，并能改善酒體香氣和口感。還有人成功地將耐寒的葡萄汁酵母菌和不耐寒的釀酒酵母進(jìn)行了雜交[13]，選育出的酵母菌可在5℃～10℃條件下具有較好的發(fā)酵能力，有利于果香型葡萄酒的釀造。我國(guó)在葡萄酒酵母雜交育種方面的研究還較少。

酵母菌雜交育種也存在一定局限性，主要是由于酵母菌的多倍體基因排列，使得自然界中能形成孢子的菌株出現(xiàn)幾率很小，還有一些特殊的酵母菌屬間雜交不會(huì)將結(jié)合子的理想特性傳遞給子代，另外，能夠被交換或傳遞到子代、結(jié)合子上的理想性狀特點(diǎn)也是有限的。

2.4 原生質(zhì)體融合

原和質(zhì)體融合是將2種不同菌株的原生質(zhì)體（球）置于高滲溶液中，在一定融合劑的促融作用下相互凝集并發(fā)生細(xì)胞之間的融合，進(jìn)而導(dǎo)致基因重組，獲得融合了親本優(yōu)良性能新菌株的育種方法，這種技術(shù)可以在屬內(nèi)和屬間進(jìn)行。國(guó)外曾報(bào)道過一些重要的工業(yè)用釀酒酵母菌就是自然界中屬間雜交的結(jié)果[14]。有人通過跨界融合釀酒酵母和葡萄汁酵母發(fā)現(xiàn)，融合子所產(chǎn)的葡萄酒中的副產(chǎn)物的含量大約是親本的一半，因?yàn)樵撚H本具有過高的產(chǎn)酸、產(chǎn)甘油以及產(chǎn)苯乙醇的能力[13]。國(guó)內(nèi)有人對(duì)釀酒酵母與酒類酒球菌（Oenos.oeni）進(jìn)行了跨界融合，發(fā)現(xiàn)融合子質(zhì)粒DNA中存在蘋果酸-乳酸酶基因MleP和蘋果酸-乳酸透性酶基因MleP，從而實(shí)現(xiàn)了葡萄酒降酸[15]。國(guó)內(nèi)還有研究將葡萄酒酵母與裂殖酵母進(jìn)行融合，選育出能夠一步降解蘋果酸的酵母[16]；以及利用單滅活原生質(zhì)體融合技術(shù)選育出降酸能力強(qiáng)的酵母菌株[17]。

此技術(shù)具有雜交頻率較高、受接合型限制較小、遺傳物質(zhì)完整等優(yōu)點(diǎn)，但是，由于所獲得的融合子其遺傳穩(wěn)定性較差，通常理想特點(diǎn)的表達(dá)是偶然的。再加上缺乏遺傳標(biāo)記，用做工業(yè)菌種還是有一定的障礙。

2.5 基因工程育種

上述的酵母改良技術(shù)都是隨機(jī)地改變菌種特性，缺乏特異性和準(zhǔn)確性。基因工程育種克服了這一缺點(diǎn)，把理想的外源DNA片段克隆或插入到葡萄酒釀酒酵母菌基因的特定位置中，實(shí)現(xiàn)DNA重組，使其得到表達(dá)，并穩(wěn)定遺傳而不改變受體原有特性。

在研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)一個(gè)或者幾個(gè)已知基因編碼優(yōu)良特征時(shí)，基因工程菌的構(gòu)建是容易且可行的。有人構(gòu)建了具有果膠降解、葡聚糖降解和木聚糖降解能力的釀酒酵母，使葡萄酒澄清變得容易[18]。有人通過構(gòu)建能充分表達(dá)甘油磷酸脫氫酶基因的高產(chǎn)甘油酵母菌，釀造出了低醇兼有圓潤(rùn)酒體香的葡萄酒[19]。由于釀酒酵母中沒有蘋果酸乳酸途徑，又缺乏蘋果酸運(yùn)輸系統(tǒng)，因此有人將乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）中的蘋乳酶基因和粟酒裂殖酵母 （Schizosaccharomyces pombe）中的蘋果酸透性酶基因轉(zhuǎn)入釀酒酵母而成功降酸，解決了冷涼產(chǎn)區(qū)葡萄酒生物降酸的難題[20-21]。有人發(fā)現(xiàn)在單倍體和二倍體階段進(jìn)行基因處理，可在自溶程度、酒精耐受性和工藝可行性方面明顯提高起泡葡萄酒的質(zhì)量[22]。有人利用氮代謝的調(diào)節(jié)機(jī)制，構(gòu)建了促進(jìn)尿素酰氨分解酶表達(dá)的基因工程菌，有效降低了酒中尿素的含量，從而大幅降低了葡萄酒中氨基甲酸乙酯的濃度[23]。還有人描述了通過構(gòu)建KNR4基因敲除酵母菌，細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和成分得以改變，增加了葡萄酒中甘露糖蛋白的表達(dá)，還有效防止了葡萄酒蛋白質(zhì)渾濁[24]。

然而例如發(fā)酵力，產(chǎn)酒精能力，耐受性和培養(yǎng)溫度等工藝特征因素并不是由單一的或少數(shù)幾個(gè)基因控制的，決定這些特性的基因往往廣泛分布于整個(gè)酵母菌基因組中，有科學(xué)家已推測(cè)出決定酒精耐受性的基因多于250個(gè)，而這些位點(diǎn)通常是我們了解很少又分布很廣的。盡管近幾年微衛(wèi)星和單核苷酸多態(tài)性方法成功地用于繪制基因譜圖,但是像這樣特征復(fù)雜的基因識(shí)別仍然是當(dāng)前遺傳學(xué)的一個(gè)挑戰(zhàn)。因此僅利用基因工程菌的構(gòu)建仍然不能解決這些因素帶來(lái)的問題。

近年來(lái)一項(xiàng)不改變單個(gè)基因，而是隨機(jī)地改變整個(gè)基因組的基因組改組（Genome shuffling）技術(shù)引起了研究人員極大的興趣，它在誘變基礎(chǔ)上通過細(xì)胞融合技術(shù)，對(duì)誘變后的細(xì)胞進(jìn)行重組，從而使正向突變菌株的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合在一起。它能將多重親本的優(yōu)良性狀在體外整合到一個(gè)子代身上，快速地完成優(yōu)良性狀的重組和選育，被稱為遞推式多次融合。但是由于缺乏有效的識(shí)別復(fù)雜表型的方法，和將具有理想特征的子代從龐大的重組菌種庫(kù)中有效分離出來(lái)的方法，這一技術(shù)還沒有在葡萄酒酵母中獲得應(yīng)用，如果這一瓶頸得以攻克，該技術(shù)將成為酵母選育的一個(gè)重要的里程碑，且基于其自然選育的原則，產(chǎn)生的后代將不會(huì)冠以“轉(zhuǎn)基因菌”的頭銜，因此將有很大的發(fā)展前景。

3 對(duì)我國(guó)葡萄酒酵母發(fā)展的展望

我國(guó)葡萄酒年產(chǎn)量在2009年已經(jīng)達(dá)到93萬(wàn)t，躋身世界葡萄酒生產(chǎn)國(guó)十強(qiáng)，但我國(guó)在葡萄酒釀酒酵母研究方面與國(guó)外相比還處于起步階段，葡萄酒行業(yè)的生產(chǎn)還以購(gòu)買使用國(guó)外商用酵母為主。由于我國(guó)釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)分布廣泛，土壤氣候條件存在具有較大差異，因此不同產(chǎn)區(qū)的葡萄原料在品種、品質(zhì)、特征等方面存在較大的差異。如何根據(jù)不同產(chǎn)區(qū)葡萄品種的特點(diǎn)，選育適合發(fā)揮我國(guó)本土原料優(yōu)勢(shì)特性的釀酒酵母，是從事葡萄酒科研工作者需要面對(duì)的問題。例如通過適宜的菌種選育，在我國(guó)東部產(chǎn)區(qū)推廣釀造口感柔和細(xì)膩的新鮮果香型葡萄酒、在我國(guó)中西部產(chǎn)區(qū)推廣釀造口感濃郁醇厚的陳釀型葡萄酒是我國(guó)葡萄酒行業(yè)未來(lái)發(fā)展的一個(gè)基本方向。

從技術(shù)角度來(lái)講，釀酒酵母作為一個(gè)實(shí)驗(yàn)室真菌模型，其生理生化、基因和分子生物學(xué)特性已經(jīng)為大家所熟知，但實(shí)驗(yàn)室菌種和工業(yè)菌種在遺傳和生理方面仍然有很大不同，還需進(jìn)一步研究。無(wú)論是理性的DNA重組技術(shù)還是隨機(jī)的誘變或者雜交融合等技術(shù)，都有優(yōu)缺點(diǎn)，都會(huì)遇到困難，我們應(yīng)該按照選育出發(fā)點(diǎn)的不同，揚(yáng)長(zhǎng)避短，各種技術(shù)互為補(bǔ)充、配合使用，努力培育出具有我國(guó)產(chǎn)區(qū)特色的本土葡萄酒酵母，為提高我國(guó)葡萄酒的整體質(zhì)量，推動(dòng)我國(guó)的葡萄酒產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)步健康發(fā)展提供可靠的技術(shù)支持。

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