李巨秀，張朝紅，房紅娟，魏江華

（西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

桑椹（Mublberry），又稱(chēng)桑棗、桑果，為?？粕僦参锷＃∕orass alba L.）的成熟聚花果[1-3]。桑椹中含有豐富的多酚類(lèi)化合物，主要是矢車(chē)菊-3-葡萄糖苷和矢車(chē)菊-3-蕓香苷為主的花青素類(lèi)[4-5]。而花色苷不僅可作為食品天然著色劑，也是一種重要的抗氧化劑，具有顯著的自由基清除能力，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化（Lipid Peroxidation）和低密度脂蛋白氧化（LDL Oxidation），降低細(xì)胞中活性氧的水平，具有預(yù)防和治療一些慢性流行病（chronic diseases）的生理功能，如癌癥、神經(jīng)退化性疾病、炎癥以及心血管疾病[6-10]。

乙醇由于其成本低、毒性小、易回收等特點(diǎn)，成為提取多酚化合物最常用的試劑[11]。本試驗(yàn)以桑椹果為試驗(yàn)材料，以乙醇溶液為提取劑，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，分別研究乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度、提取pH對(duì)桑椹總多酚得率的影響，為桑椹資源的開(kāi)發(fā)以及桑椹產(chǎn)品功能特性的評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

1.1.1 材料

桑椹：由西北農(nóng)林科技大學(xué)蠶桑絲綢研究所提供。2009年5月采摘，將剛采摘的成熟鮮桑椹，用清水洗凈后在自然陰涼處瀝干水分，每2 kg分裝在一袋，在袋中放入一包冷凍劑，存入-40℃冰箱中，備用。

1.1.2 主要試劑

Folin試劑：上海喜潤(rùn)化學(xué)工業(yè)有限公司；沒(méi)食子酸：科邦生物有限公司；無(wú)水碳酸鈉、無(wú)水乙醇、鹽酸：均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

UV-1240紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；BFM-GBI貝利粉碎機(jī)：濟(jì)南貝利粉技術(shù)工程有限公司；KDC-40低速離心機(jī)：科大創(chuàng)新股份中佳分公司；R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士步琪公司；HH-S6電熱恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑椹總多酚的分析方法

用福林酚法測(cè)定桑椹多酚類(lèi)化合物含量。

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

用10mL蒸餾水溶解0.05g沒(méi)食子酸，定容至500mL，分別移取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL到100 mL容量瓶中，各加入50 mL蒸餾水，加入福林酚試劑1 mL后搖勻，靜置4 min～5 min，加入15% 的Na2CO3溶液2 mL，用蒸餾水定容，置于25℃的恒溫水浴鍋中60 min反應(yīng)。將反應(yīng)顯色后的樣品溶液，置于分光光度計(jì)波長(zhǎng)為760 nm下測(cè)定吸光光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo)，以沒(méi)食子酸濃度為橫坐標(biāo)繪制曲線。所得到的線性方程為y=0.0811x，R2=0.9986，y為吸光度，x為沒(méi)食子酸濃度（μg/mL）。

1.3.1.2 樣品測(cè)定

取提取的桑椹樣品1 mL加入到100 mL容量瓶中，加入50 mL蒸餾水振蕩搖勻，加入Folin酚試劑1 mL搖勻，靜置約4 min～5 min，加入15% 的Na2CO3溶液2 mL，混勻后用蒸餾水定容至刻度，置于25℃的恒溫水浴中反應(yīng)60 min，在760 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出所對(duì)應(yīng)的多酚含量，然后根據(jù)公式（1）計(jì)算桑椹多酚的得率。

式中：M為桑椹多酚的得率；μg/g，A為吸光度；N為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，g。

1.3.2 桑椹總多酚提取的單因素試驗(yàn)

以桑椹總多酚得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別對(duì)乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度、提取pH進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以確定各因素對(duì)桑椹總多酚提取效果的影響和適宜的范圍。所有處理均進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。

1.3.3 桑椹中總多酚提取的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以提取濃度（A）、提取料液比（B）、提取時(shí)間（C）、提取溫度（D）、提取酸度（E）為影響因素，以桑椹總多酚得率為指標(biāo)，選用L16（45）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表，優(yōu)化提取工藝參數(shù)，做兩次重復(fù)試驗(yàn)。因素水平表見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of L16（45）orthogonal experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 桑椹多酚提取單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對(duì)桑椹多酚提取的影響

取桑椹樣品2 g，按料液比為1：10（g/mL）比例分別加入pH為5的0%、20%、40%、60%、80%、95%的乙醇溶液后迅速密封，在60℃恒溫水浴中提取1 h。提取結(jié)束后用紗布進(jìn)行粗過(guò)濾，然后將粗濾液在3000 r/min下離心10 min，將上清液完全轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶，定容后測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 乙醇濃度對(duì)桑椹多酚提取的影響Fig.1 Influences of ethanol concentration on yield of total polyphenols from mulberry

從圖1中可以看出，隨著乙醇濃度增大，提取的桑椹多酚得率隨之增大。在乙醇濃度為60%時(shí)，總多酚得率達(dá)到最大值，而隨著乙醇濃度進(jìn)一步增大，多酚得率開(kāi)始下降，下降到一定值后，在乙醇濃度為80%時(shí)，趨于平緩，得率變化減小。故選取乙醇濃度為60%作為進(jìn)一步試驗(yàn)的總多酚提取劑。

2.1.2 料液比對(duì)桑椹多酚提取的影響

取桑椹樣品2 g，分別取料液比（g/mL）為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，以pH為5的60%乙醇溶液為提取溶劑，密封后在60℃的恒溫水浴中提取1 h。提取結(jié)束后將提取液用紗布粗過(guò)濾，再將粗濾液在3000 r/min下離心10 min，將上清液完全傾入100 mL容量瓶，定容后測(cè)定，分析結(jié)果見(jiàn)圖2。

從圖2中可以看出，當(dāng)隨著料液比（g/mL）比例增大時(shí)，桑椹總多酚得率隨之增大。在料液比（g/mL）為1∶15時(shí)，桑椹多酚得率達(dá)到最大值，而隨著料液比（g/mL）比例逐步增大時(shí)，得率開(kāi)始下降，當(dāng)從料液比（g/mL）為1∶20至1∶30之間時(shí)，總多酚得率變化較小。所以選取提取料液（g/mL）比為1∶15時(shí)較適宜。

圖2 料液比對(duì)桑椹總多酚得率的影響Fig.2 Influences of ratio of mulberry to ethanol on yield oftotal polyphenols from mulberry

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)桑椹多酚提取的影響

取桑椹樣品2 g，按料液比（g/mL）1∶10比例加入pH為5的60%乙醇，在60℃的恒溫水浴分別提取30、60、90、120、150、180、210 min，結(jié)束后將提取液用紗布粗過(guò)濾，粗濾液在3000 r/min下離心10 min，將上清液完全傾入100 mL容量瓶，定容后測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)桑椹多酚提取的影響Fig.3 Influences of extraction time on yield of total polyphenols from mulberry

從圖3中可以看出，當(dāng)提取時(shí)間增大時(shí)，總多酚得率沒(méi)有顯著變化。當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到120 min時(shí)，桑椹多酚得率值達(dá)到最大。隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，總多酚得率有所下降。若提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，不僅雜質(zhì)溶出較多，同時(shí)使得多酚化合物長(zhǎng)時(shí)間受熱分解損失，因此確定提取時(shí)間為120 min較為適宜。

2.1.4 提取溫度對(duì)桑椹多酚提取的影響

取桑椹樣品2 g，按料液比（g/mL）1∶10比例加入pH為5的60%乙醇溶液，分別在溫度為20、30、40、50、60、70、80℃提取1 h。提取結(jié)束后提取液用紗布粗過(guò)濾，粗濾液在3000 r/min下離心10 min，將上清液完全傾入100 mL容量瓶，定容后測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖4。

從圖4中可以看出，隨著提取溫度升高時(shí)，總多酚得率迅速上升。在提取溫度為60℃時(shí)，桑椹總多酚得率達(dá)到最大，若提取溫度增高，多酚得率又開(kāi)始迅速下降，這可能與多酚化合物的熱不穩(wěn)定性有關(guān)，因此選定提取溫度為60℃為宜。

2.1.5 提取pH對(duì)桑椹多酚提取的影響

圖4 提取溫度對(duì)桑椹多酚提取的影響Fig.4 Influences of temperature on filed of total polyphenols from mulberry

取桑椹樣品2 g，按料液比（g/mL）為1∶10比例加入不同pH的60%乙醇，pH分別為2、3、4、5、6、7，在60 ℃的恒溫水浴中提取1 h。提取結(jié)束后提取液用紗布粗過(guò)濾，粗濾液在3000 r/min下離心10 min，將上清液完全傾入100 mL容量瓶，定容后測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 提取pH對(duì)桑椹多酚提取的影響Fig.5 Influences of pH value on field of total polyphenols from mulberry

從圖5中可以看出，當(dāng)隨著提取酸度減小即pH增大時(shí)，桑椹總多酚得率隨之增大，并且在提取溶劑pH為4時(shí)，得率達(dá)到最大值。而隨著提取溶劑pH增大，提取量值又開(kāi)始迅速下降。故溶劑的pH為4時(shí)提取效果較好。由于在中性及堿性pH下都會(huì)破壞多酚化合物的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其損失。因此，一般在酸性條件下可以保護(hù)多酚化合物，從而提高提取得率。

2.2 桑椹多酚提取工藝的優(yōu)化

在以上單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以桑椹總多酚得率為指標(biāo)，采用五因素四水平正交試驗(yàn)方案對(duì)提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，考察乙醇濃度、提取料液比、提取時(shí)間、提取溫度以及提取溶劑pH桑椹總多酚得率的影響。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

由極差分析可以看出（表2），5個(gè)因素對(duì)多酚提取效果影響的主次順序?yàn)椋篈>C>D>B>E，即提取溶劑濃度>提取時(shí)間>提取溫度>提取料液比>提取pH。試驗(yàn)所得最佳優(yōu)化工藝組合為A3B3C3D4E2，即乙醇為65%、料液比1∶15（g/mL）、提取時(shí)間120 min、提取溫度65 ℃、提取為pH為4。

從表3方差分析可知，乙醇濃度和提取時(shí)間對(duì)桑椹總多酚得率在α=0.01水平上有極顯著的影響，料液比、提取溫度和pH在α=0.05水平上對(duì)桑椹總多酚得率均有顯著的影響。

表2 桑椹總多酚的提取正交試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Results of the orthogonal experiment of extraction total polyphenol from mulberry

表3 正交設(shè)計(jì)方差分析表Table 3 Variance analysis of experimental results

由于得到的優(yōu)化組合不在正交試驗(yàn)組合中，對(duì)優(yōu)化組合進(jìn)行了2次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，經(jīng)分析，桑椹總多酚得率為6709μg/g，說(shuō)明該工藝可行。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)其桑椹總多酚提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到優(yōu)化的提取工藝參數(shù)為：乙醇濃度為65%、料液比為1∶15（g/mL）、提取時(shí)間為120 min、提取溫度為65℃、提取的pH為4。在此條件下總多酚的提取含量是6709μg/g。

通過(guò)極差分析和方差分析，影響桑椹總多酚提取效果的因素主次順序?yàn)樘崛∪軇舛?提取時(shí)間>提取溫度>提取料液比>提取酸度，并且乙醇濃度和提取時(shí)間在0.01水平上對(duì)桑椹總多酚的提取有極顯著的影響，料液比、提取溫度和pH在0.05水平上對(duì)桑椹總多酚的提取有極顯著的影響。

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