王 衛(wèi)，叢 喆，劉 浩，陶 真，劉 強(qiáng)，魏 強(qiáng)，陳志偉，秦 川

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021;2.香港大學(xué)李嘉誠(chéng)醫(yī)學(xué)院艾滋病研究所，香港 999077)

體內(nèi)CD8+T細(xì)胞剔除對(duì)無癥狀期SHIV感染猴的影響

王 衛(wèi)1，叢 喆1，劉 浩1，陶 真1，劉 強(qiáng)1，魏 強(qiáng)1，陳志偉2，秦 川1

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021;2.香港大學(xué)李嘉誠(chéng)醫(yī)學(xué)院艾滋病研究所，香港 999077)

目的 CD8+T細(xì)胞在一些病毒感染疾病的免疫反應(yīng)中起著重要的作用，但CD8+T細(xì)胞在HIV無癥狀期的作用尚不明確，本研究通過體內(nèi)CD8+T細(xì)胞剔除，研究CD8+T細(xì)胞對(duì)SHIV感染猴的影響，進(jìn)一步了解艾滋病的發(fā)病機(jī)制。方法 選擇8只SHIV病毒感染的恒河猴，均處于無癥狀期，隨機(jī)分成兩組，實(shí)驗(yàn)組4只恒河猴在0、3、7 d注射抗CD8+T抗體cM-T807，不同的時(shí)間取外周血、腹股溝淋巴結(jié)。流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定恒河猴外周血和淋巴結(jié)中CD8+T細(xì)胞數(shù)目，Real-time RT-PCR法測(cè)定實(shí)驗(yàn)猴血漿病毒載量，并使用IFN-γ Elispot方法測(cè)定其對(duì)猴細(xì)胞免疫的影響。結(jié)果 CD8+T細(xì)胞敲除后，4只猴的病毒載量都轉(zhuǎn)陽，但反應(yīng)性不一，HIV-1的靶細(xì)胞CD4+T細(xì)胞有輕微下降，后反彈，與病毒載量無相關(guān)性;CD8敲除猴的感染情況(血漿病毒載量和CD4細(xì)胞)比SHIV病毒急性感染輕，這與ELIPOT結(jié)果一致。結(jié)論 CD8+T細(xì)胞在HIV無癥狀期發(fā)揮重要的作用，但其作用具有個(gè)體差別。

SHIV;恒河猴;CD8+T細(xì)胞;模型，動(dòng)物;無癥狀期

CD8+T細(xì)胞在一些病毒性感染疾病的免疫反應(yīng)中起著重要的作用，尤其在研究HIV、SIV等病毒發(fā)病機(jī)理中，發(fā)現(xiàn)與病毒復(fù)制水平有密切相關(guān)［1，2］。近期的研究表明:HIV/SIV特異的CD8+T細(xì)胞在整個(gè) HIV-1 感染期間扮演重要作用［3，4］。測(cè)定CD8+T細(xì)胞的作用，了解其功能有助于闡明體內(nèi)CD8+T細(xì)胞與感染病毒的復(fù)制、致病機(jī)制的相互作用［5］。研究CD8+T細(xì)胞在艾滋病無癥狀期的作用，確定CD8+T細(xì)胞對(duì)病毒復(fù)制的壓制作用，了解CD8+T細(xì)胞敲除對(duì)HIV-1靶細(xì)胞數(shù)量的影響，研究該疾病過程與病毒急性感染的異同，分析細(xì)胞免疫、體液免疫的反應(yīng)情況，將進(jìn)一步了解艾滋病無癥狀期的致病機(jī)理，對(duì)艾滋病研究有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:恒河猴4只，由北京協(xié)爾鑫生物資源研究所提供［SCXK(京)2005-2005］，用商品化膨化飼料飼養(yǎng)。體重3～5 kg。實(shí)驗(yàn)前經(jīng)體檢無異常，經(jīng)血清學(xué)間接免疫熒光抗體檢查法(IFA)檢查排除猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆轉(zhuǎn)錄 D型病毒(SRV-1，2，5)和猴 T淋巴細(xì)胞性 I型病毒(STLV-1)的感染。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在ABSL-3實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。

1.1.2 毒株:pSHIV-KB9 5′和 pSHIV-KB9 3′由 NIH AIDS Research and Reference Reagent Program提供，連接后轉(zhuǎn)染T293細(xì)胞得到SHIV-KB9病毒，經(jīng)PCR鑒定和細(xì)胞滴定。

1.1.3 抗體及試劑:抗 CD8+T抗體 cM-T807，由NIH Nonhuman Primate Reagent Resource提供?？贵wCD8-FITC(克隆號(hào):DK25)購自 Dako公司，CD3-PE(克隆號(hào):SP34)、CD4-PerCP(克隆號(hào):L200)購自BD公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組:恒河猴8只，隨機(jī)分成2組，每組4只。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物分別在0 d經(jīng)皮下(后頸背部)和3、7 d靜脈(后肢靜脈)注射cM-T807抗體。第1次劑量10 mg/kg，第2、3次劑量 5 mg/kg。分別在 0、7、14、21、28、42 d 采集外周血 5 mL(EDTA 抗凝)，同時(shí)活檢取腹股溝淋巴結(jié)0.5 mg。另外4只注射0.85%生理鹽水作為對(duì)照。

1.2.2 臨床觀察:抗體接種后，每天觀察動(dòng)物臨床癥狀，如攝食量變化、活動(dòng)情況、精神狀態(tài)等。

1.2.3 CD8 T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)的測(cè)定:

1.2.3.1 外周血淋巴細(xì)胞懸液的制備:取50 μL的EDTA抗凝血加到12×75 mm Falcon管中，標(biāo)記抗CD3、CD4、CD8抗體，在室溫避光作用 15 min后，加入終濃度10%的溶血素，在4℃下作用10 min。后用 pH 7.2 PBS洗 2次，懸浮于 500 μL的 pH 7.2 PBS中，48 h內(nèi)上機(jī)在 BD Calibur FACS儀上分類計(jì)數(shù)。

1.2.3.2 淋巴結(jié)組織細(xì)胞懸液的制備:取體積約為(1×1×1)mm的新鮮淋巴結(jié)組織，將其置于盛有0.5 mL 10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基的小平皿的200目尼龍紗網(wǎng)上，去除包膜，剪碎。以網(wǎng)搓法輕搓組織塊，再加入0.5 mL 10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基沖洗。收集細(xì)胞懸液，于200目尼龍紗網(wǎng)過濾。用10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基洗1次，0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液染色計(jì)數(shù)細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞濃度至106/mL。標(biāo)記抗 CD3、CD4、CD8抗體，在室溫避光作用15 min。用10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基洗2次，懸浮于500 μL的2%多聚甲醛PBS中，48 h內(nèi)上機(jī)在BD Calibur FACS儀上分類計(jì)數(shù)。

1.2.4 病毒載量的檢測(cè):Trizol法提取血漿中病毒RNA，Quantitect SYBR Green RT-PCR Kit(Qiagen，204243)Roche LightCycler熒光定量?jī)x測(cè)定血漿病毒 RNA載量，該方法靈敏性為103copies/mL［6］。

1.2.5 CD4+T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)檢測(cè):根據(jù)流式細(xì)胞儀測(cè)定的 CD4+/CD8+比值、血常規(guī)結(jié)果，計(jì)算出CD4+T 細(xì)胞絕對(duì)數(shù)［7］。

1.2.6 細(xì)胞免疫反應(yīng):用 Monkey IFN-r ELISPOT Kit(U-Cytech，CT126-PR20)檢測(cè)針對(duì) SIV肽庫的IFN-r分泌性 ELISPOT反應(yīng)，肽庫為 NIH提供的SIVmac239肽庫，Gag(Item#6204)、Env(Item#6883)、Pol(Item#6443)，反應(yīng)終濃度為 1.33 μg/mL［8］。

2 結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn)

cM-T807抗體注射后，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物出現(xiàn)不同程度的消瘦、腹瀉等急性感染癥狀，其中 RH039癥狀較輕微，RH029癥狀較重，持續(xù)至實(shí)驗(yàn)開始后35 d，瀕死解剖。對(duì)照組動(dòng)物未見明顯異常。

2.2 外周血CD8+T細(xì)胞數(shù)目變化

在注射抗體后，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的外周血 CD8+T細(xì)胞數(shù)目下降迅速，注射后第4天到第21天外周血一直維持在0～2個(gè)/μL，之后有輕微上升，到第49天實(shí)驗(yàn)結(jié)束未回升到初始水平;對(duì)照組動(dòng)物則未見明顯特異性變化(圖1)。

圖1 外周血CD8+T細(xì)胞數(shù)目變化Fig.1 The number of CD8+T cells in peripheral blood

2.3 淋巴結(jié)CD8+T細(xì)胞百分比

在明確外周血CD8+T細(xì)胞后，還測(cè)定了淋巴結(jié)CD8+T細(xì)胞百分比。結(jié)果表明，在抗體注射后21 d，cM-T807實(shí)驗(yàn)組CD8+T細(xì)胞百分比的均值為4.925%，對(duì)照組為23.9%;到抗體效果回復(fù)的第49天，cM-T807實(shí)驗(yàn)組 CD8+T細(xì)胞百分比上升到21.225%，對(duì)照組為較接近的24.4%(圖2)。

圖2 外周淋巴結(jié)CD8+T細(xì)胞數(shù)目Fig.2 The number of CD8+T cells in lymph nodes

2.4 CD4+T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)和血漿病毒載量

在抗體注射后，監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血漿病毒載量和CD4+T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的血漿病毒載量從開始在檢測(cè)靈敏線以下上升到104～106copies/mL，其中 RH002和 RH029的水平最高，都在 106copies/mL以上，RH031和 RH039較低，尤其是RH039，僅在第10天檢出過一次載量。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)照組動(dòng)物的血漿病毒載量位于檢測(cè)靈敏線以下(圖3)。

在抗體注射后，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的CD4+T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)有輕微的下降，之后回升，而且回升幅度較大，比初始水平高;但RH029動(dòng)物的CD4+T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)一直維持在一個(gè)較低的水平，對(duì)照組動(dòng)物未見明顯變化。

2.5 CD8+T細(xì)胞去除與SHIV 首次感染對(duì)比

在CD8+T細(xì)胞剔除后，免疫壓力降低，病毒大量復(fù)制，與病毒首次感染類似。進(jìn)行兩者比較，能更好的分析CD8+T細(xì)胞剔除的意義。結(jié)果表明，從平均值來看，CD8+T細(xì)胞剔除后的病毒復(fù)制比首次感染低，首次感染都位于106～108copies/mL之間，而且首次感染病毒復(fù)制維持時(shí)間較長(zhǎng)，在感染后49 d仍能檢測(cè)出病毒;同時(shí)，CD4 T細(xì)胞數(shù)量有較為嚴(yán)重的下降，尤其以RH019嚴(yán)重(圖4)。

2.6 IFN-γ ELISPOT 結(jié)果

之后，我們分析了實(shí)驗(yàn)猴的細(xì)胞免疫，第3周的IFN-γ ELISPOT結(jié)果顯示，RH039的細(xì)胞免疫最強(qiáng)，達(dá)到2300 SFC/106PBMC，RH029的細(xì)胞免疫最低，RH002和RH031在兩者之間，其中與 GAG2和GAG1刺激的斑點(diǎn)為主;與第6周的IFN-γ ELISPOT結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)RH002和 RH031有一定程度的上升，而RH029更低了，其中g(shù)ag2刺激的斑點(diǎn)顯著增加(圖5)。

圖3 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組動(dòng)物CD4+T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)和血漿病毒載量結(jié)果Fig.3 The absolute number of CD4+T cells and plasma viral load of the experimental and control groups

圖4 CD8+T細(xì)胞去除與SHIV首次感染動(dòng)物CD4+T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)和血漿病毒載量結(jié)果Fig.4 The absolute number of CD4+T cells and plasma viral load of experimental animals after CD8+T cell depletion and SHIV-KB9 first infection

圖5 實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物注射抗體后第3周和第6周的IFN-γ ELISPOT結(jié)果Fig.5 The results of IFN-γ Elispot of experimental animals at 3 weeks and 6 weeks after CD8+T cell depletion

3 討論

艾滋病是嚴(yán)重威脅人類健康的傳染性疾病之一［9］。HIV-1感染的自然史分為急性感染期、無癥狀期和艾滋病期［10］。根據(jù)無癥狀期的長(zhǎng)短，又可以把HIV-1感染者分為快速進(jìn)展者、長(zhǎng)期存活者和典型進(jìn)展者。研究表明:HIV-1感染者無癥狀期的狀況決定了病程的進(jìn)展。CD8+T細(xì)胞在一些病毒性感染疾病的免疫反應(yīng)中起著重要的作用，尤其在研究HIV、SIV等病毒發(fā)病機(jī)理中，發(fā)現(xiàn)與病毒復(fù)制水平有密切相關(guān)［1，2］。測(cè)定 CD8+T細(xì)胞的作用，了解其功能有助于闡明體內(nèi)CD8+T細(xì)胞與感染病毒的復(fù)制、致病機(jī)制的相互作用［5］。近期的研究表明:HIV/SIV特異的CD8+T細(xì)胞在整個(gè)HIV-1感染期間扮演重要作用［3，4］。在本研究中，使用SHIV恒河猴動(dòng)物模型，通過體內(nèi) CD8細(xì)胞的剔除，研究 CD8細(xì)胞對(duì)艾滋病的影響;這對(duì)了解艾滋病發(fā)病機(jī)制，進(jìn)行艾滋病疫苗研發(fā)具有現(xiàn)實(shí)意義。

Schmitz JE 等［11，12］人使用鼠 M-T807 雜交瘤分離出來的重鏈輕鏈可變區(qū)基因分別連接到人γ1重鏈和κ輕鏈基因，連接表達(dá)質(zhì)粒，并傳染到 SP2/0-AG14細(xì)胞，得到人鼠雜合單克隆抗體，命名為cMT807。并用于印度恒河猴，取得較好的CD8細(xì)胞剔除效果。喬紅偉等［13］通過 cM-T807抗體注射中國(guó)恒河猴建立中國(guó)恒河猴CD8+T細(xì)胞缺失模型。本實(shí)驗(yàn)中，通過類似方法注射剔除實(shí)驗(yàn)猴體內(nèi)CD8細(xì)胞，結(jié)果成功敲除4只實(shí)驗(yàn)猴的 CD8細(xì)胞，包括外周血和淋巴結(jié)，其效果好于印度恒河猴。

CD8+T細(xì)胞敲除后，4只實(shí)驗(yàn)猴的病毒載量都陽轉(zhuǎn)，說明在艾滋病無癥狀期細(xì)胞免疫具有一定保護(hù)作用，但反應(yīng)性不一，有的峰值較高，如402、429，有的復(fù)制水平較低，如431和439，說明在艾滋病無癥狀期，CD8細(xì)胞參與抑制病毒的復(fù)制，但不是唯一的抑制因素。這與ELIPOT結(jié)果一致，說明SHIV特異細(xì)胞免疫在艾滋病無癥狀期具有重要的保護(hù)作用。429的細(xì)胞免疫缺乏，是其發(fā)病死亡的原因之一。

CD8+T細(xì)胞敲除后，HIV-1的靶細(xì)胞－CD4+T細(xì)胞有輕微下降，后反彈，與病毒載量具有相關(guān)性，這與說明CD4細(xì)胞損失主要是因?yàn)樽陨砻庖邠p傷，與病毒復(fù)制殺傷關(guān)系不大;另一方面，CD4細(xì)胞損失后反彈說明猴體本身存在反饋機(jī)制，并能不斷的補(bǔ)充新生的CD4細(xì)胞，證明其免疫再生系統(tǒng)還未衰減，而CD4細(xì)胞損失后不反彈或反彈較輕微，如429，可能是由于其免疫再生系統(tǒng)已經(jīng)衰竭，不能產(chǎn)生新的CD4 T細(xì)胞。

CD8+T細(xì)胞剔除后，病毒大量復(fù)制，刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生壓制作用，相當(dāng)于進(jìn)行了一次病毒感染。我們把這次的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與之前相同病毒首次感染4只中國(guó)恒河猴的結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果表明，CD8敲除猴的感染情況(血漿病毒載量和 CD4細(xì)胞)比SHIV病毒急性感染輕，說明特異性體液免疫在免疫壓制病毒復(fù)制中具有一定意義。經(jīng)過CD8敲除，病毒大量復(fù)制，相當(dāng)于進(jìn)行了一次感染，其GAG2對(duì)應(yīng)的細(xì)胞免疫增強(qiáng)，說明這段抗原能有效誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，其在疫苗設(shè)計(jì)中具有一定意義。

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Effect of CD8+T Cell Depletion in Vivo on Monkeys with Chronic SHIV-KB9 Infection

WANG Wei1，CONG Zhe1，LIU Hao1，TAO Zhen1，LIU Qiang1，WEI Qiang1，CHEN Zhi-wei2，QIN Chuan1
(1.Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Health;Institute of Medical Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences;Key Laboratory of Human Disease Animal Models，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021，China;2.AIDS Institute，Li Ka Shing Faculty of Medicine，The University of Hong Kong，Hong Kong 999077，China)

ObjectiveCD8+T cells play an important role in some viral diseases，but the role of CD8+T cells is not yet fully clear in the asymptomatic phase of HIV infection.The aim of this study was to elucidate the impact of CD8+T cell in SHIV-infected monkeys with in vivo CD8+T cells depletion，and to further understand the pathogenesis of AIDS.MethodsEight SHIV-infected rhesus monkeys in the asymptomatic phase were selected and randomly divided into two groups.Anti-CD8+T antibody cM-T807 were injected intravenously into four monkeys on days 0，3，and 7.Then the CD8+T cell number in peripheral blood and lymph nodes in the monkeys were detected by flow cytometry，the plasma viralload by real-time RT-PCR，and the cellular immunity by IFN-γ Elispot assay.ResultsThe viral load of the four monkeys was elevated to above of detected after the CD8+T cell depletion，but the reactions were not uniform.CD4+T cells，the HIV-1 target cells，rebound and dropped slightly.The infection of monkeys with CD8+T cell depletion was lighter than that after the SHIV virus first infection(plasma viral load and CD4 cells)，which was consistent with the Elispot results.Conclusions CD8+T cells play an important role in the asymptomatic phase of HIV-1 infection，but with some interindividual variation.

SHIV，infection;Rhesus monkey;CD8+T cell;Model，animal;Asymptomatic phase

R373;R33

】A

1671-7856(2011)04-0001-05

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.04.001

科技重大專項(xiàng)－艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治(2009ZX10004-402，008ZX10001-002)，中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(DWS 201009)。

王衛(wèi)(1981－)，男，助理研究員，從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒免疫學(xué)研究工作。

秦川，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病理學(xué)。E-mail:qinchuan@pumc.edu.cn。

2010-10-11