劉巧榮，包新奇，孫 明，王 芳，喬明明，李 佳，陳曦，秦亞嫚，陳西釗，2

(1.北京世紀元亨動物防疫技術有限公司，北京 100085;2.中國動物疫病預防控制中心，北京 100085;3.江蘇省動物疫病預防控制中心，南京 210036)

感染CDV的犬病料N、H、F基因的克隆與序列分析

劉巧榮1，包新奇3，孫 明1，王 芳1，喬明明1，李 佳1，陳曦1，秦亞嫚1，陳西釗1，2

(1.北京世紀元亨動物防疫技術有限公司，北京 100085;2.中國動物疫病預防控制中心，北京 100085;3.江蘇省動物疫病預防控制中心，南京 210036)

目的 了解病料中犬瘟熱病毒(CDV)的變異情況，為犬瘟熱的預防與治療提供理論依據(jù)。方法 采用RT-PCR方法對犬病料中CDV的血凝素蛋白(H)、融合蛋白(F)和核衣殼蛋白(N)基因進行擴增，將擴增產(chǎn)物克隆到pGEM-T-easy載體中測序，并進行序列分析。結果 測定一株 CDV的 H、F和 N基因大小分別為1863 bp、1653 bp和2235 bp。同源性分析表明，未發(fā)現(xiàn)堿基的插入和缺失。該病毒的 H、F和 N基因分別與國內(nèi)強毒株BJ080127株的H基因、GN株的F基因和HL株的N基因親緣關系最近，氨基酸同源性分別為97.3%、97.7%和99.3%。與國外標準野毒株A75-17在核苷酸水平上同源性依次為94.4%、93.8%和97.2%，與疫苗株CDV3在核苷酸水平上同源性分別為88.5%、88.8%和93.9%。系統(tǒng)進化樹表明該病毒與國內(nèi)強毒株在同一譜系。糖基化分析顯示，該病毒在F基因3～5位氨基酸處多出1個糖基化位點。結論 本研究從犬病料中成功克隆了犬瘟熱病毒血凝素蛋白、融合蛋白和核衣殼蛋白，在F基因中新增了一個糖基化位點，為犬瘟熱的遺傳變異和流行學研究提供了分子生物學依據(jù)。

犬瘟熱;血凝素蛋白基因;融合蛋白基因;核衣殼蛋白基因;序列分析S

犬瘟熱(canine distemper，CD)是由犬瘟熱病毒(canine distemper virus，CDV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病。該病毒屬于副粘病毒科、麻疹病毒屬的單股負鏈RNA病毒。在自然狀態(tài)下感染犬科、鼬科、浣熊科等多種動物。是養(yǎng)犬業(yè)、毛皮獸養(yǎng)殖業(yè)的主要傳染病。目前，CDV自然感染的動物范圍還有不斷擴大的趨勢，甚至已擴展到偶蹄目豬科及靈長類獼猴屬等動物［8］。也有日本學者報道 CDV可感染人［1］，其危害越來越大。因此，本研究對CDV的有效防治具有重要意義。

CDV基因組全長15690 bp，編碼6種結構蛋白，分別為核衣殼蛋白(N)、膜蛋白(M)、磷蛋白(P)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白(H)、大蛋白(L)。其中F、H和N蛋白是主要的結構蛋白，在機體免疫原性與致病性上發(fā)揮著重要作用。本研究從感染CDV的犬病料中克隆出N、H、F基因，與國內(nèi)外的CDV毒株進行遺傳關系比較，旨在分析其在基因水平上發(fā)生的遺傳變化，為CDV基因序列數(shù)據(jù)庫的豐富和CDV分子流行病學的深入研究提供新的實驗數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病料和毒株

病料由中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院提供。2008年12月，1只3月齡喜樂蒂犬，臨床癥狀有疑似犬瘟熱，經(jīng)過RT-PCR方法和膠體金試劑盒檢測為陽性，確診為犬瘟熱。

1.2 載體、菌株和主要試劑

pGEM-T-Easy載體購自于Promega公司，JM109感受態(tài)細胞購自于北京全式金生物技術有限公司。EX-Taq酶為TaKaRa公司產(chǎn)品，總RNA提取試劑盒為Bioflux公司產(chǎn)品，膠回收試劑盒為Omega產(chǎn)品。

1.3 引物的設計與合成

根據(jù)Genbank上發(fā)表的CDV全基因序列，針對N、F、H蛋白的全基因分別設計3對引物，由上海英駿生物技術有限公司合成：

N-P1：5′-GCCTTCTTAARAGCCT-3′

N-P2：5′-TTGTTGGACCTGGGTCCTAAGT-3′

擴增N基因

F-P1：5′-TAATCAAAACTTAGGGTCCAGGA-3′

F-P2：5′-CTACCTGAGCCCTAAGTTTTCT-3′

擴增F基因

H-P1：5′-GCTCAGGTAGTCCARCAATGCT-3′

H-P2：5′-GARATGTGTATCATYATACTGTCA-3′

擴增H基因。

1.4 RNA的提取

將犬瘟熱病料的肺組織研磨成勻漿，8 000 r/min 離心 4 min，取上清液 100 μL，按照 Bioflux RNA提取試劑盒操作說明提取病毒總RNA。

1.5 RT-PCR反應

25 μL反應體系中加入DEPC處理的滅菌雙蒸水 12.5 μL，5 × PCR buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.5 μL，10 pmol/L 引物 1.5 μL，AMV 反轉錄酶 0.2 μL(10 U/μL)，RNA 酶抑制劑 0.3 μL(40 U/μL)，TaqDNA 聚合酶 1 μL(5 U/μL)，模板 2 μL。PCR 擴增程序如下，42℃ 1 h，95℃ 3 min;95℃ 45 s，退火溫度分別為 44℃ 、46℃ 、50℃ 和 52℃ ，72℃ 90 s，各 10循環(huán);72℃擴增10 min。

1.6 擴增產(chǎn)物的克隆及測序

RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，用膠回收試劑盒回收純化擴增的目的基因片段，按照pGEM-T easy載體操作手冊進行連接，轉化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞。用PCR篩選陽性克隆，將陽性克隆送上海英駿生物技術有限公司進行測序。

1.7 目的基因序列同源性分析與比較

應用DNAman和DNAStar生物軟件分析目的基因序列，并將N、F、H基因序列和推導的氨基酸序列與GenBank上的CDV代表毒株進行同源性分析比較，繪制系統(tǒng)進化樹。

2 結果與分析

2.1 RT-PCR擴增結果

用設計的3對引物對感染肺組織的RNA進行RT-PCR擴增，得到了與N、F、H設計大小一致的目的片段，其片段長度分別約為1 600 bp、2 200 bp和1 800 bp。與預期大小一致(圖1)，將病毒命名為CDV-WZ。

2.2 克隆鑒定和測序結果

重組質粒經(jīng)PCR鑒定顯示，成功將3個基因片段克隆到pGEM-T-Easy載體中。陽性質粒經(jīng)上海英駿生物技術有限公司測序表明，擴增的H、F和N大小分別為1 863 bp、2 235 bp和1 653 bp，未發(fā)現(xiàn)堿基的插入和缺失。

2.3 序列同源性分析結果

N基因與Genbank中22株CDV毒株在核苷酸水平上同源性為(CDV3)93.3% ～97.4%(HL)，氨基酸水平上同源性為(CDV3)96.9%～99.3%(HL)。該 CDV-WZ和國外標準野毒株 A75-17和5804核苷酸水平上同源性為97.2%和96.3%，氨基酸水平同源性為98.5%和97.7%;與國外疫苗株Onderstepoort核苷酸水平上同源性為93.9%，氨基酸水平同源性為97.1%，表明該病毒N基因相對保守，變異小。

F基因與其他CDV毒株在核苷酸水平上同源性為(CDV3和 Onderstepoort)88.8% ～98.7%(GN和SC01)，氨基酸水平上同源性為(Onderstepoort)89.0% ～98.8%(TW-TN1)。該 CDV-WZ和野毒株Strain A75-17和Strain 5804核苷酸水平上同源性為93.8%和93.1%，氨基酸水平同源性均為93.5%;與標準疫苗株Onderstepoort核苷酸水平上同源性為88.8%，氨基酸水平同源性為89.0%。另外，由 F基因推導的氨基酸分析表明，F(xiàn)蛋白含有13個半胱氨酸殘基，7個潛在的糖基化位點。

H基因與其他CDV毒株在核苷酸水平上同源性為(Onderstepoort和 Vaccine strain Japan)88.1%～97.6%(BJ080127)，氨基酸水平上同源性為(Convac vaccine strain)89.1% ～97.3%(BJ080127)。該CDV-WZ和野毒株Strain A75-17和Strain 5804核苷酸水平上同源性為94.4%和93.8%，氨基酸水平同源性為94.4%和94.1%;與疫苗株Onderstepoort和 Strain CDV3核苷酸水平上同源性為88.1%和88.5%，氨基酸水平同源性為89.7%和90.1%。另外，H蛋白氨基酸分析結果顯示，H半胱氨酸殘基數(shù)目及位置是保守的，沒有變化，為13個;糖基化位點為9個。

2.4 系統(tǒng)進化樹分析結果

將N、H、F三段基因推斷的氨基酸序列和相應代表株進行比對，利用DNAman軟件繪制進化樹，在系統(tǒng)發(fā)生樹上可分為強毒和弱毒兩大譜系。CDV-WZ位于強毒株譜系，與國內(nèi)外使用疫苗株親緣關系很遠，可能對CDV免疫保護效果有一定影響。

圖2 N基因氨基酸系統(tǒng)進化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree of the N gene amino acids

N蛋白與其他CDV毒株的系統(tǒng)進化樹顯示，CDV-WZ與2007年黑龍江從狐貍分離的 HL強毒株在一個分支。F蛋白與其他毒株的系統(tǒng)進化樹表明(圖3)，CDV-WZ和黑龍江2007年從浣熊分離的強毒株GN強毒株歸為一組。而從H基因推導的氨基酸系統(tǒng)發(fā)生樹上看，CDV-WZ和北京新分離的BJ080127強毒株在同一分支，與遼寧2007年從浣熊分離的LN(07)1、山東2008年從狐貍分離的SD(08)1以及GN毒株在同一大的分組;同時與近幾年分離的 HeB(07)1、JL(08)1、HLJ(08)2強毒株也很接近。

從系統(tǒng)進化樹可以看出，最新分離的毒株通常在進化樹的末端，但也有例外的，如山東2008年從狐貍分離的HT-P毒株就在進化樹的較前部(圖4)。這基本說明CDV各毒株在不斷地發(fā)生新的變異。從地域來看，國外和國內(nèi)毒株還是存在較大差異，這可能與環(huán)境、原始毒株以及不同的選擇免疫壓力有關。從國內(nèi)來看，南北差異不大，如新疆2003年分離的 TN、浙江2008年分離的 HZ026、湖北2006年分離的 BS0610、HLJ(08)2、JL(08)1以及 HeB(07)1又在同一大的分支上(圖3和圖4)。此外，從不同種動物分離的毒株間的差異也在不斷縮小。這可能與近年來區(qū)域間的頻繁交流、不同動物的混養(yǎng)等有較大的關系。

圖3 F基因氨基酸系統(tǒng)進化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree of the F gene amino acids

圖4 H基因氨基酸系統(tǒng)進化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree of the H gene amino acids

3 討論

N蛋白是保守性最強的免疫原性蛋白，含有B細胞和T細胞表位，在診斷和細胞免疫方面發(fā)揮著重要作用，對病毒裝配、轉錄和復制過程起調控作用。F蛋白介導囊膜和細胞膜融合，決定病毒在宿主體內(nèi)擴散的能力，盡管該基因相對保守，但其微小的改變會對CDV毒力強弱產(chǎn)生影響。H蛋白位于病毒粒子的表面，是誘導機體產(chǎn)生中和抗體的主要抗原之一，同時，H蛋白決定著病毒感染宿主的特異性，并協(xié)助F蛋白使 CDV進入宿主細胞［6，7］。故H蛋白基因成為國內(nèi)外學者研究CDV遺傳變異規(guī)律的首選基因［14，15］。

本研究病毒的F和H基因分別與Strain BS0610、Strain GN、Strain SC01、Strain TW-TN1 和BJ080127、Hamamatsu、HB062、TN 有較高的同源性，在系統(tǒng)分類上與野毒株較近，屬于強毒株。用本研究病料接種45日齡健康比格犬，出現(xiàn)了明顯的雙相熱，并出現(xiàn)了100%的死亡率，充分驗證了CDV-WZ為強毒。F、H基因及其推導的氨基酸和國內(nèi)外疫苗株的同源性均較低，有可能對犬瘟熱免疫保護有一定影響。這與王君瑋等對狐、貉和水貂源共5株CDV野毒和疫苗株部分H基因氨基酸序列分析的結果相類似［2］。近幾年日本免疫犬暴發(fā)了犬瘟熱，經(jīng)研究表明，可能與H蛋白抗原性變化有關［9］。

H蛋白屬于典型的II型糖蛋白，在病毒的吸附和侵入宿主細胞過程中起重要作用。文獻報道，所有CDV野毒株H蛋白均存在8～9個潛在的N-聯(lián)糖基化位點，而疫苗株為4個(Onderstepoort株)或7個(Convac株)，H蛋白N-聯(lián)糖基化位點的差異可能影響病毒的抗原性［8，9］。另有研究證實，在麻疹病毒屬所有結構蛋白中，H蛋白基因變異最大［9，11-13］，抗原變化最大［15］。在免疫壓力作用下，CDV抗原表位可能發(fā)生漂移，較大的H蛋白極易發(fā)生變異，從而引起 CDV 毒力的變化［16，17］。H 蛋白作為誘導機體產(chǎn)生中和抗體的主要保護性抗原，其抗原性的改變很可能導致CDV野毒逃避機體的免疫監(jiān)視，共同特征之一是造成CDV在不同種動物之間，不同地區(qū)以不同毒株的形式大面積爆發(fā)［18］。

在CDV所有結構蛋白中，N蛋白是保守性最強的免疫原性蛋白。N蛋白在337～358位或者1～80位的氨基酸存在B細胞表位，其中1～80位氨基酸是N蛋白轉運到細胞核所必需的［1］。281～289位即Y P A L G L H E F連續(xù)9個氨基酸高度保守，是T細胞表位，在細胞免疫中發(fā)揮重要的功能［10］。Pascal Cherpillod等［19］證實CDV N蛋白可以刺激機體產(chǎn)生強烈的抗體反應，當H和F蛋白的特異性抗體低于檢測水平時，N蛋白的特異性抗體仍可以檢測到，這也揭示出N蛋白在CDV感染的檢測中具有重要的意義。本研究克隆了整個開放閱讀框，核苷酸和推導的氨基酸同源性分析顯示，N蛋白的保守性較H和F蛋白高，進一步驗證了N蛋白較高的保守性。

F蛋白是典型的 I型糖蛋白，在病毒侵入機體和刺激機體產(chǎn)生免疫保護性反應中發(fā)揮著重要作用，其誘導的免疫反應能阻止病毒感染，抑制犬瘟熱臨床癥狀產(chǎn)生。F蛋白的 T細胞表位(288～302aa)和B細胞表位(404～414aa)構成嵌合多肽，能誘導保護性免疫反應［3，4］。研究發(fā)現(xiàn)該蛋白基因相對比較保守［5］，在診斷上亦具有一定的價值。在CDV-WZ的F蛋白中，對蛋白的二級結構起著重要作用的13個Cys殘基位置與其它毒株一致，對蛋白的裂解、穩(wěn)定性和生物學活性都很重要的4個潛在的N-聯(lián)糖基化位點也完全保守。與其它大部分CDV毒株(糖基化位點4～6個)相比，在 CDV-WZ氨基酸的3～5位置多出了1個糖基化位點。這對F抗原性的影響還有待進一步的研究。

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Cloning and Sequence Analysis of Canine Distemper Virus N，F(xiàn) and H Genes from the Samples Infected with CDV

LIU Qiao-rong1，BAO Xin-qi3，SUN Ming1，Wang Fang1，QIAO Ming-ming1，LI Jia1，CHEN Xi1，QIN Ya-man1，CHEN Xi-zhao1，2
(1.Beijing ANHEAL Laboratories Co.Ltd，Beijing 100085，China;2.China Animal Disease Control Center，Beijing 100085;3.Jiangsu Animal Disease Control Center，Nanjing 210036，China)

Objective The aim of this study was to identify the variations of canine distemper viruses(CDV)obtained from clinical samples，and provide a theoretical basis for the prevention and control of CDV infection.Methods The segments of hemagglutinin protein(H)gene，fusion protein(F)gene and nucleocapsid protein(N)gene were amplified by RT-PCR.The amplicons were cloned into pGEM-T-easy vector and the recombination clones were sequenced.Subsequently，the nucleotide and amino acid sequences were analyzed.Results The nucleotide lengths of H，F(xiàn) and N genes for the virus were 1863 bp，1653 bp and 2234 bp，respectively.Sequence analysis did not present any nucleotide insertion or deletion.The three sequences determined in this study showed the high amino acid identities corresponding with three Chinese highly pathogenic CDV isolates BJ080127(H gene)，GN(F gene)and HL(N gene)，which were 97.3% ，97.7%and 99.3% ，respectively.Meanwhile，each of them displayed the nucleotide identity of 94.4% ，93.8%and 97.2% ，when compared with the CDV prototypic strain A75-17.In addition，comparing with the CDV vaccine strain CDV3，they displayed the nucleotide similarities of 88.5% ，88.8%and 93.9% ，respectively.The glycosylation sites analyses revealed a glycosylation site aimed at the 3～5 amino acids of F gene.The phylogenetic tree displayed that the virus had the closest relationship with the highly pathogenic CDV isolates identified in China.Conclusion In this study，we cloned the H，F(xiàn) and N genes of a CDV determined in canine samples and identified that the virus is a highly pathogenic CDV，which contains a novel glycosylation site in F gene.This study provides evidence in studies on the molecular mutation epidemiology of CDV infection.

Canine distemper virus;Hemagglutinin protein gene;Fusion protein gene;Nucleocapsid protein gene;Sequence analysis

R33

A

1671-7856(2011)04-0037-05

2010-10-12

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.04.009

劉巧榮(1979-)女，碩士。主要研究方向：動物疫病診斷。

陳西釗，博士，研究員，Email：chenxizhao@anheal.com。