趙 寧，惲時鋒，王 芳，范志宇，胡 波，劉 濤

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動物疫病免疫與診斷重點開放實驗室，國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210014;2.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科，江蘇 南京 210002)

家兔支氣管敗血波氏桿菌重組蛋白DNT1的原核表達及其間接ELISA方法的建立

趙 寧1，惲時鋒2，王 芳1，范志宇1，胡 波1，劉 濤1

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動物疫病免疫與診斷重點開放實驗室，國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210014;2.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科，江蘇 南京 210002)

目的 表達支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica，Bb)DNT蛋白，并以此建立檢測Bb抗體的間接ELISA方法。方法 參照GenBank公布的豬源支氣管敗血波氏桿菌dnt基因序列(AB020025)針對其N-端設(shè)計了一對特異性引物，PCR擴增出相應(yīng)的核苷酸片段。將PCR擴增產(chǎn)物連接至原核表達載體 pET-28a(+)載體中，以E.coli BL21(DE3)為表達菌株進行誘導(dǎo)表達，以純化重組蛋白DNT1作為診斷抗原，通過探索最佳抗原包被量和抗體血清稀釋倍數(shù)，建立檢測支氣管敗血波氏桿菌重組蛋白DNT1抗體的ELISA方法。結(jié)果 成功克隆了dnt N-端的基因序列，并在E.coli BL21(DE3)中獲得高效表達，經(jīng) SDS-PAGE、Western blot分析顯示重組蛋白 DNT1具有良好的抗原性。應(yīng)用重組蛋白DNT1為抗原建立了檢測Bb血清抗體的間接ELISA診斷方法。試驗確定重組蛋白DNT1抗原的包被濃度為6.25 μg/mL，最適血清稀釋度為1∶100。結(jié)論 建立的ELISA檢測方法，不僅為 Bb抗體檢測提供了一種比較實用的血清學(xué)檢測手段，也為進一步開發(fā)Bb檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

兔;支氣管敗血波氏桿菌;壞死毒素(DNT);原核表達;間接ELISA

支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica，Bb)是廣泛感染家畜、野生動物和實驗動物上呼吸道的一種革蘭氏陰性球桿菌，常引起家兔發(fā)生傳染性鼻炎和支氣管肺炎，Bb的感染常導(dǎo)致多殺性巴氏桿菌、葡萄球菌等其它細菌的繼發(fā)性感染［1，2］，從而增加實驗兔呼吸道疾病的發(fā)病率和嚴重程度，同時也為細菌學(xué)檢查增加了難度。近年來，人們發(fā)現(xiàn)Bb可經(jīng)動物傳染給人，并在免疫功能缺陷或低下的人群(如AIDS患者)體內(nèi)形成嚴重感染［3-5］，因此本病具有一定的公共衛(wèi)生意義。

Bb診斷主要是細菌學(xué)檢查、血清學(xué)凝集試驗、PCR等檢測方法［6］。常規(guī)細菌學(xué)檢查操作繁瑣、費時費力;血清凝集試驗和PCR方法常出現(xiàn)假陽性結(jié)果［7］，因此，建立一種快速、高效、敏感、特異的檢測方法對本病的防控尤為重要。研究表明，皮膚壞死毒素(dermonecrotic toxin，DNT)是Bb重要的毒力因子［8］，由dnt基因編碼，由 A-B兩個亞單位構(gòu)成，A亞單位(C端)為毒素的活性中心，B亞單位(N端)稱結(jié)合單位，能使毒素分子特異性地結(jié)合在宿主易感組織的細胞膜受體上，并協(xié)助A亞單位穿過細胞膜［9-11］。本研究將 N端結(jié)合單位命名為 DNT1，并以臨床病例中分離的高毒力Bb菌株(BJL0504)的基因組為模板，對其進行了克隆、序列分析及原核表達，并將表達蛋白作為抗原，建立了檢測Bb抗體的間接ELISA方法，為更好地防治本病奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌種與血清

兔支氣管敗血波氏桿菌株(BJL0504，Ⅰ相菌)，由范志宇等分離鑒定并保存［12］;BL21(DE3)、原核表達載體pET-28a(+)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)所保存;兔支氣管敗血波氏桿菌陰、陽性血清自行制備并保存;綿羊血采自江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)所;待檢血清100份采自江蘇省境內(nèi)4個兔場。

1.2 主要試劑

Sac I、HindⅢ、TaqDNA聚合酶和PCR回收純化試劑盒、IPTG等購自大連寶生物工程有限公司;His Trap純化柱購于GE Healthcare;EB、瓊脂糖購于南京基天生物技術(shù)有限公司;牛血清白蛋白(BSA)、酶標羊抗兔IgG(HRP-IgG)購自生物晶美公司;TMBS購自Amersco公司。

1.3 引物設(shè)計與PCR擴增

參照GenBank公布的豬源支氣管敗血波氏桿菌dnt基因序列(AB020025)針對 N-端(DNT1)設(shè)計了一對特異性引物：

上游引物：5′-CATGAGCTCCGCCTGGATTAC-3′

下游引物：5′-TGGAAGCTTGGGCGTGGAAAA-3′

為了便于構(gòu)建表達載體，在上、下游引物5′端分別加入Sac I和 HindⅢ酶切位點(引物中下劃線部分)。PCR擴增條件為：以Bb I相菌基因組為模板，進行 PCR擴增，95℃預(yù)熱 5 min;94℃變性 1 min，58℃退火 1 min，72℃延伸 1.5 min，35 個循環(huán)，72℃延伸10 min，冷卻至4℃保存。取 PCR擴增產(chǎn)物10 μL，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍攝、分析結(jié)果。用凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

1.4 dnt1基因的克隆與鑒定

取PCR產(chǎn)物和原核表達載體 pET-28a(+)適量，用Sac I、HindⅢ 酶消化，連接，轉(zhuǎn)化，得到重組質(zhì)粒pET-28a-dnt1。將初選的陽性質(zhì)粒分別進行 Sac I、HindⅢ 雙酶切、PCR及測序鑒定。

1.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達與純化

重組表達載體 pET-28a-dnt1轉(zhuǎn)入 E.coli BL21(DE3)中。將含有陽性重組質(zhì)粒 pET-28a-dnt1和pET-28a(+)空載體的 E.coli BL21(DE3)單個菌落，分別接種于3 mL LB(Kan+)液體培養(yǎng)基，37℃200 r/min搖振培養(yǎng) 2 h左右，使 A600達到 0.4～0.6。加入終濃度為1 mmol/L的 IPTG，37℃誘導(dǎo)表達6 h。取適量誘導(dǎo)表達后的細菌沉淀物經(jīng)超聲波裂解，加入含8 mol/L尿素的Binding buffer進行充分溶解，然后按His Trap純化柱說明書進行純化。

1.6 重組蛋白的SDS-PAGE及Western blot分析

按照文獻［13］介紹的方法進行重組蛋白的SDS-PAGE及Western blot分析，一抗為兔抗 Bb高免血清，二抗為 HRP標記的羊抗兔 IgG，按照 DAB顯色液試劑盒顯色。

1.7 間接ELISA檢測方法的建立

1.7.1 重組蛋白和待檢血清最佳工作濃度的確定：將純化后的重組蛋白DNT1用抗原包被液分別作100 、50 、25 、12.5、6.25、3.125 μg/mL 共 8 個梯度稀釋，100 μL/孔，37℃孵育 2 h，4℃ 過夜。次日棄去包被液，PBST洗滌5次拍干。用2%BSA封閉，200 μL/孔，37℃封閉1.5 h。用血清稀釋液將陰、陽性血清分別作 1：100、1：200、1：400 倍比稀釋，做ELISA 方陣試驗，100 μL/孔，37℃ 孵育 30 min，確定抗原和血清的最適工作濃度。HRP-羊抗兔 IgG做1：20 000 稀釋，100 μL/孔，37℃ 孵育 60 min。新鮮配制的 TMBS-H2O2底物顯色液，37℃避光顯色10 min。每孔 50 μL 2 mol/L H2SO4中止反應(yīng)，測定A450值。比較陽性血清和陰性血清A450比值(P/N)，以確定合適的抗原包被濃度以及待測血清的最佳稀釋度。

1.7.2 判定標準的確定：取鑒定為Bb抗體陰性的50份兔血清，按照已確立的間接ELISA方法進行檢測。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，得到A450平均值X和標準差 S。根據(jù)統(tǒng)計學(xué)原理，A450值≥X +3S時，判為陽性。A450值≤X+2S者判為陰性，介于二者之間者判為可疑。

1.7.3 阻斷試驗：取5份波氏桿菌陽性血清作最佳稀釋，與等量重組蛋白抗原DNT1(50 μg/mL)混合，37℃作用2 h，10 000 r/min離心10 min，取上清液，與未經(jīng)抗原處理的陰、陽性血清一起，同時作ELISA檢測。計算(N-P)/N值，若此值大于0.5，則判為阻斷陽性。

(N-P)/N=(未阻斷孔A值-阻斷孔A值)/未阻斷孔A值

1.7.4 重復(fù)性試驗：取6份陽性血清、3份陰性血清在不同時間相同條件下，重復(fù)檢測3次，觀察A450值的變化。

1.7.5 臨床應(yīng)用：分別對江蘇省境內(nèi)4個兔場的家兔采集血清，每個兔場隨機采集25份，用建立的間接ELISA方法對這100份血清進行檢測，初步評價應(yīng)用效果及兔場Bb感染情況。

2 結(jié)果

2.1 dnt1基因的擴增

以支氣管敗血波氏桿菌Ⅰ相菌(BJL0504)為模板進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，在1 600 bp左右處有特異條帶，與預(yù)期大小相符(圖 1)。

圖1 dnt1基因的PCR結(jié)果Note：M： DNA marker(DL2000)1：PCR products of dnt1 geneFig.1 PCR products of dnt1 gene

2.2 重組表達質(zhì)粒pET-28a-dnt1的鑒定

使用引物對重組表達質(zhì)粒進行PCR擴增，在預(yù)期大小處得到了特異性條帶;進一步對其進行雙酶切鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，得到與預(yù)期片段大小一致的特異條帶(圖2);測序結(jié)果顯示，克隆的兔Bb dnt1基因序列與GenBank公布的4個豬源 dnt基因序列：U59687、AB020025、E17214、NP890512 相比，核苷酸同源性高達99%以上，說明成功構(gòu)建了目的片段的重組表達質(zhì)粒pET-28a-dnt1。

2.3 SDS-PAGE及Western blot結(jié)果

表達的重組蛋白經(jīng)His Trap純化柱純化后，用12%的聚丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE檢測，結(jié)果表明pET-28a-dnt1在誘導(dǎo)后出現(xiàn)一條大小約為60 KDa的特異性蛋白條帶，與預(yù)期大小基本一致，命名為DNT1(圖3-4泳道)，紫外分光光度計檢測純度為3 mg/mL。

圖2 重組質(zhì)粒pET-28a-dnt1的酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pET-28adnt1 by enzyme digestion

圖3 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果和Western blot分析Fig.3 SDS-PAGE(B)and Western blot(A)analyses

Western blot顯示，DNT1融合蛋白在約60KDa處出現(xiàn)很強的特異性反應(yīng)條帶(圖3-2泳道)，質(zhì)粒pET28a(+)誘導(dǎo)表達后在預(yù)期位置處無反應(yīng)條帶(圖3-1泳道)，表明重組蛋白在大腸桿菌中得到了正確表達，并具有良好的反應(yīng)原性。

2.4 間接ELISA檢測方法的建立

2.4.1 重組蛋白和待檢血清最佳工作濃度的確定：通過方陣滴定試驗，不同梯度陰、陽性血清和抗原的反應(yīng)結(jié)果見表1。確定重組蛋白DNT1抗原和血清的最佳工作條件為：抗原最佳包被濃度為6.25μg/ml，血清最佳稀釋倍數(shù)為 1∶100。

2.4.2 結(jié)果判定：50份健康兔血清用建立的ELISA方法進行檢測。結(jié)果表明，重組蛋白 DNT1包被板的平均 A450值(x)為0.066，標準差(SD)為0.052，臨界值x+3S=0.222。據(jù)此，確定血清樣品A450≥0.222，且 P/N≥2.1，方可判為陽性;A450≤0.170為陰性;介于二者之間判為可疑。

2.4.3 阻斷實驗：重組蛋白DNT1抗原處理血清的阻斷抑制率為88.0%。證明重組蛋白DNT1對血清抗體與包被抗原的結(jié)合有很強的抑制作用，包被抗原與血清抗體的結(jié)合是特異的。

2.4.4 重復(fù)性試驗：取同一批次重組蛋白包被酶標板，在不同時間相同條件下檢測9份血清，重復(fù)檢測3次。以結(jié)果判定為標準，所得檢測結(jié)果完全相同。2.4.5臨床應(yīng)用：用建立的間接ELISA方法對采自江蘇境內(nèi)4個兔場的100份血清進行檢測，總陽性率為56.7%，說明本地兔場Bb的感染率較高，應(yīng)引起高度關(guān)注。

表1 重組蛋白DNT1和血清的不同稀釋度反應(yīng)結(jié)果Tab.1 Reaction results of the recombinant protein of DNT1 and different serum dilutions

3 討論

DNT是 Bb的主要毒力因子，早在1979年，有人將I相菌經(jīng)超聲波處理后得到的無菌抽提物成功地人工復(fù)制豬萎縮性鼻炎，當接種于仔豬鼻腔后，可產(chǎn)生和自然感染時萎縮性鼻炎相似的鼻部損傷。此外，毒素也可能通過損壞呼吸道內(nèi)正常保護層上皮細胞而間接地促進菌株附著作用［14-15］。DNT可以通過去酰氨基和多聚Rho蛋白來促進Bb纖毛運動，還可以促使宿主中DNT受體細胞膜的增殖以及內(nèi)化的形成，從而加快粘附宿主細胞。天然DNT的分泌量非常有限，且純化工藝復(fù)雜，人工表達全毒素的效率也較低，通過提純天然和體外表達來制備DNT較困難。因此，本試驗將結(jié)合位點命名為DNT1進行了克隆與表達，并將其作為ELISA包被抗原以檢測動物體內(nèi)特異的DNT抗體，從而診斷兔群是否發(fā)生了波氏桿菌病。

以自行分離的兔源Bb的基因組為模板進行克隆，克隆出的dnt基因通過核苷酸和氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)與GenBank公布4個豬源DNT基因序列相比，均有99%以上的同源性。這表明該基因高度保守，可考慮作為波氏桿菌病的檢測抗原和亞單位疫苗研究的候選基因。Western blot分析表明，重組蛋白DNT1呈現(xiàn)良好的特異性抗原反應(yīng)。此外，該基因在大腸桿菌中獲得大量表達，為進一步開發(fā)為診斷試劑盒抗原奠定基礎(chǔ)。用建立的ELISA方法對江蘇4個兔場進行了監(jiān)測，100份血清樣品的總陽性率為56.7%，這說明江蘇地區(qū)兔場波氏桿菌的感染率較高，應(yīng)引起高度關(guān)注。

以純化的重組蛋白DNT1為包被抗原建立的檢測Bb抗體的間接ELISA方法具有良好的重復(fù)性、特異性和敏感性。其克服了細菌分離鑒定較為繁瑣費時和PCR檢測易出現(xiàn)假陽性的缺點;此外，包被抗原易于純化，ELISA操作方法簡單。因此，本研究建立的新方法，有望成為一種準確、快速和實用的兔Bb病血清學(xué)診斷方法。

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Prokaryotic Expression of Bordetella Bronchiseptica DNT1 Recombinant Protein from Rabbits and Development of an Indirect ELISA for Detection of Its Antibodies

ZHAO Ning1，YUN Shi-feng2，WANG Fang1，F(xiàn)AN Zhi-yu1，HU Bo1，LIU Tao1
(1.Institute of Veterinary Medicine，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Animal Disease Diagnostics and Immunology，Ministry of Agriculture，National Center for Engineering Research of Veterinary Bio-Products，Nanjing 210014，China;2.Department of Comparative Medicine，Nanjing General Hospital of Nanjing Command，Nanjing 210002)

Objective To get expression of Bordetella bronchiseptic recombinant protein DNT1 and establish an indirect ELISA for detection of recombinant protein DNT1.Method According to a pair of specific primers designed toamplify DNT gene of Bordetella bronchiseptica in swines promulgated by Genbank，the fragment of the target gene was amplified by PCR and then constructed with prokaryotic expression vector PET-28a(+).The recombinant expression plasmids were transfected into BL21(DE3)strain.The optimal concentration of coated antigen recombinant protein DNT1 and serum dilution was determined to develop the ELISA technique.Results DNT1 gene of Bordetella bronchiseptica was successfully cloned and expressed.The SDS-PAGE and Western blot analysis unfolded the excellent immunogenicity of the recombinant proteins which were used as coating antigens to develop the ELISA method for Bb-specific antibody diagnosis.The peridium consistency of the recombinant protein DNT1 determined in this experiment was 6.25 μg/mL，and the optimal testing serum dilution was 1：100.Conclusion The development of DNT1 indirect ELISA offers a simple and practical way for monitoring antibody of Bb，and provides much information for laying a basis for development of a Bb diagnosis kit.

Rabbits; Bordetella bronchiseptica; Dermonecrotic toxin(DNT); Prokaryotic expression;Indirect ELISA

R33

A

1671-7856(2011)04-0047-05

2010-11-10

10.3969/j.issn.1671-7856.2011.04.011

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項(nyhyzx07-040);現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金資助項目(nycytx-44);江蘇省科技支撐計劃——農(nóng)業(yè)部分(BE2008372)。

趙寧(1985-)，女，碩士，主要從事畜禽傳染病防治學(xué)研究，E-mail：zhaoningnjau@126.com。

惲時鋒(1965-)，男，教授，博士，從事醫(yī)學(xué)實驗動物學(xué)專業(yè)，E-mail：yunshifeng1@163.com;王芳(1972-)，女，副研究員，博士，主要從事畜禽傳染病免疫機理及診斷方法研究，E-mail：rwangfang@126.com。