王 芳，何 吉，朱發(fā)明，劉晉輝，秦 斐，陳 舒，徐 罡，呂行軍，嚴力行

浙江省血液中心 血液安全研究衛(wèi)生部重點實驗室，杭州 310006

·論著·

應用Solexa技術(shù)檢測臍血CD34+細胞體外誘導的巨核細胞mRNA表達

王 芳，何 吉，朱發(fā)明，劉晉輝，秦 斐，陳 舒，徐 罡，呂行軍，嚴力行

浙江省血液中心 血液安全研究衛(wèi)生部重點實驗室，杭州 310006

目的應用Solexa技術(shù)研究人臍帶血CD34+細胞體外誘導巨核細胞的mRNA表達。方法采用密度梯度離心法和免疫磁珠分選系統(tǒng)獲取人臍帶血CD34+細胞。100 ng/ml 促血小板生成素誘導培養(yǎng)12 d后，應用抗CD41+單克隆抗體免疫磁珠法分選獲得巨核細胞和非巨核細胞。應用Solexa技術(shù)檢測巨核細胞和非巨核細胞的mRNA表達差異。結(jié)果獲取的Tag初始數(shù)量巨核細胞和非巨核細胞分別為 3 773 147 和 3 533 805 個。整個清晰的Tag數(shù)量分別為 3 291 132和 2 967 947 個，明顯獨特的tag數(shù)量分別為 197 769 和 245 318 個。其中上調(diào)基因表達數(shù)量為1161個，下調(diào)為902個。上調(diào)Tag表達數(shù)量為2717個，下調(diào)為1519個。結(jié)論巨核細胞和非巨核細胞 mRNA表達存在顯著差異，差異基因編碼產(chǎn)物與細胞發(fā)育、黏附、凋亡、代謝、細胞內(nèi)及細胞間的信號轉(zhuǎn)導以及免疫應答等功能相關(guān)，進一步深入將有助于探討巨核細胞的表達機制、信號傳導及調(diào)控機制。

巨核細胞；mRNA表達；體外擴增；Solexa測序

造血干細胞分化成巨核細胞進而產(chǎn)生血小板，涉及到巨核細胞系各期細胞的形成、血小板的入胞和出胞等，是一個復雜的過程，到目前為止其分子機制仍不明確。本研究采用人臍血干細胞體外促血小板生成素(thrombopoietin, TPO)誘導擴增分化為巨核細胞，應用Solexa測序技術(shù)檢測巨核細胞和非巨核細胞的mRNA表達差異，探討巨核細胞的表達機制、信號傳導及調(diào)控機制。

材料和方法

材料臍帶血由浙江大學附屬婦產(chǎn)醫(yī)院提供；IMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640購自美國Gibco公司； TPO、無血清培養(yǎng)基(Stem SpanTMSFEM)購自加拿大Stem Cell公司；鼠抗人CD41a一抗購自捷克Exbio公司；CD34細胞免疫磁珠分選試劑盒購自德國美天尼公司；羊抗鼠IgG免疫磁珠購自美國DYNAL公司；光學顯微鏡購自Nikon公司；RNA抽提試劑盒(QIAamp RNA Blood Mini Kit)購自德國Qiagen公司；Solexa測序及軟件分析由杭州華大基因研發(fā)中心提供。

CD34+細胞的體外分離、純化、擴增培養(yǎng)和誘導分化臍帶血標本與0.9%生理鹽水以1∶1充分混勻，形成單細胞懸液層加到比重為1.077 g/ml的淋巴細胞分離液上，離心收集中間的單個核細胞層，用RPMI 1640培養(yǎng)液離心洗滌2次。利用免疫磁珠分選系統(tǒng)，分選CD34+造血祖細胞。將富集的細胞用含100 ng/ml TPO無血清培養(yǎng)基混勻后，1×105/ml接種到培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%飽和CO2濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 d，第7天半量換液。

巨核細胞的免疫分離法將培養(yǎng)的細胞按1×106個細胞懸液中加入1 μg鼠抗人CD41a抗體，2～8℃孵育10 min，然后用含0.1%牛血清白蛋白的Buffer(pH 7.4)洗滌，300×g離心8 min，棄去上清，重新懸浮細胞。再加入羊抗鼠免疫磁珠(每1×107個細胞中25 μl)顛倒旋轉(zhuǎn)混勻后2～8℃孵育30 min，每10分鐘混勻1次。再將試管放置于磁鐵中2 min，收集上清中的非巨核細胞，取去磁鐵，用Buffer重懸細胞。重復操作3次。

總RNA提取采用RNA抽提試劑盒，嚴格按照試劑盒內(nèi)說明書操作。應用Agilent 2100生物分析儀進行總RNA的質(zhì)量檢驗。

Solexa測序?qū)⒊樘岷玫腞NA用干冰送至華大基因研發(fā)中心進行表達譜樣品制備、Solexa測序、信息分析。

RT-PCR驗證將抽提的巨核細胞和非巨核細胞RNA進行RT-PCR，選擇血小板反應蛋白1(thrombospondin-1，THBS1)、同源異形盒基因A9(homeobox A9，HOXA9)進行驗證。THBS1終反應體積10 μl，MgCl2終濃度1.5 mmol/L，引物終濃度為0.625 μmol/L，dNTP終濃度為200 μmol/L，Taq DNA聚合酶1.0 U。循環(huán)條件：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，63℃退火1 min，72℃延伸30 s，30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。產(chǎn)物片斷為307 bp。HOXA9終反應體積10 μl，MgCl2終濃度1.5 mmol/L，引物終濃度為0.625 μmol/L，dNTP終濃度為200 μmol/L, Taq DNA聚合酶1.0 U。循環(huán)條件：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火1 min，72℃延伸30 s，35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。產(chǎn)物片斷為264 bp。

結(jié) 果

總RNA提取結(jié)果巨核細胞RNA濃度為30 ng/μl；非巨核細胞RNA濃度為47 ng/μl，RNA純度合格，無降解。

Solexa技術(shù)檢測表達譜基本信息Solexa技術(shù)檢測MK和非MK細胞表達譜的基本情況顯示，獲取的Tag初始數(shù)量MK和非MK細胞分別為 3 773 147和 3 533 805 個，整個清晰的Tag數(shù)量分別為 3 291 132 和 2 967 947個，明顯獨特的Tag數(shù)量分別為 197 769 和 245 318 個，未知的Tag數(shù)量分別為4496和4204個，分別占清晰Tag的2.27%和1.71%。

基因在MK和非MK間表達的相關(guān)性基因在MK和非MK間表達存在一定的相關(guān)性，其中MK和非MK間基因的Spearman 等級相關(guān)系數(shù)為0.898，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.6，根據(jù)散點分布的集中性和軸向性，可以判斷實驗的重復性較好。

差異表達基因分析結(jié)果采用Solexa技術(shù)檢測，以假發(fā)現(xiàn)率≤0.001，探針的相對富集強度|log2Ratio|≥1作為判斷基因表達差異顯著的閾值。其中基因表達數(shù)量上調(diào)為1161個，下調(diào)數(shù)量為902個。Tag表達量上調(diào)為2717個，下調(diào)為1519個。差異基因功能分類主要有局部黏附、干細胞譜系、細胞外基質(zhì)-受體相互作用、DNA復制轉(zhuǎn)錄、凋亡、腫瘤發(fā)生、細胞周期發(fā)育、新陳代謝、白細胞跨膜遷移、信號轉(zhuǎn)導、細胞黏附分子、細胞骨架、免疫應答13類。

RT-PCR驗證結(jié)果THBS1在巨核細胞表達高于非巨核細胞，THBS1的相對富集強度 log2Ratio (MK/非MK)=2.645 997；HOXA9在巨核細胞表達低于非巨核細胞，HOXA9的相對富集強度 log2Ratio (MK/非MK)=-10.4315(圖1)。

討 論

Solexa技術(shù)是一種大規(guī)模高通量的測序分析技術(shù)[1-4]，它利用單分子陣列測序，此種測序法利用邊合成邊測序的原理，在每個循環(huán)過程里，將4種熒光標記的核苷和聚合酶加入到單分子陣列中，利用生物發(fā)光蛋白，通過堿基加到引物后端時所釋放出的焦磷酸鹽來提供檢測信號，熒光信號被圖像傳感器采集，圖像傳感器快速掃描整個陣列檢測特定的結(jié)合到每個片斷上的堿基。通過上述的結(jié)合，檢測可以重復幾十個循環(huán)，這樣就有可能決定核苷酸片斷中的幾十個堿基。

Solexa表達譜分析技術(shù)是基于新一代測序技術(shù)的全基因組表達譜分析方法，該方法首先從每個mRNA的3’端酶切得到一段21bp的Tag片段(特異性標記該基因),然后通過高通量測序，得到大量的Tag序列，不同的Tag序列的數(shù)量就代表了相應基因的表達量；通過生物信息學分析得到Tag代表的基因、基因表達水平以及樣品間基因表達差異等信息[5-8]。與傳統(tǒng)的基因芯片技術(shù)比較，利用高通量測序進行表達譜研究的優(yōu)勢很明顯，Solexa表達譜分析技術(shù)可直接測定每個基因的特異性表達標簽序列，通過計數(shù)表達標簽序列的數(shù)目來確定該基因的表達量，大大提高了定量分析的準確度。整體表達差異分布符合正態(tài)分布，不會因為不同批次實驗引起不必要的誤差。Solexa表達譜分析技術(shù)可重復性高，不同批次的表達譜度量準確，能夠更準確地進行表達差異分析；靈敏度高，對于表達差異不大的基因能夠靈敏的檢測其表達差異；性價比高；由于該技術(shù)不用事先設(shè)計探針，而是直接測序的方式，因此無需了解物種基因信息，可以直接對任何物種進行包括未知基因在內(nèi)的全基因組表達譜分析，因此性價比很高。高通量測序，已有數(shù)據(jù)表明，當測序通量達到200萬個表達標簽時，即可得到樣本中接近全部表達基因的表達量數(shù)據(jù)，而目前每個樣本分析可以得到300萬～600萬個表達標簽，可同時發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本、基因組表達調(diào)控區(qū)域等[5-6]。因此，目前Solexa表達譜分析技術(shù)已逐步取代基因表達系列分析和傳統(tǒng)的基因表達譜技術(shù)。

近年發(fā)現(xiàn)造血干細胞體外擴增的巨核細胞輸注到患者體內(nèi)后，能加速患者血小板的恢復，縮短血小板缺乏期，這為化療或移植后的血小板減少癥提供一個潛在的新的治療途徑。本研究采用Solexa表達譜分析技術(shù)分析人臍帶血造血干細胞分化的巨核細胞mRNA表達譜，分別獲取了MK和非MK細胞 3 773 147和 3 533 805個初始Tag，整個清晰的Tag數(shù)量分別為 3 291 132和 2 967 947個，明顯獨特的tag數(shù)量分別為 197 769和 245 318個。同時表達譜顯示約有2%的tag屬于未知的序列，提示Solexa表達譜分析技術(shù)更易發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄組。本研究發(fā)現(xiàn)1661個上調(diào)、902個下調(diào)基因和2717個上調(diào)、1519個下調(diào)標簽，這些差異基因編碼產(chǎn)物與細胞發(fā)育、黏附、凋亡、代謝、細胞內(nèi)及細胞間的信號轉(zhuǎn)導以及免疫應答等功能相關(guān)，主要有局部黏附、干細胞譜系、細胞外基質(zhì)-受體相互作用、DNA復制轉(zhuǎn)錄、凋亡、腫瘤發(fā)生、細胞周期發(fā)育、新陳代謝、白細胞跨膜遷移、信號轉(zhuǎn)導、細胞黏附分子、細胞骨架、免疫應答等13類。與非MK細胞相比，MK細胞中ZNF576、IRX3顯著上調(diào)，其在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用，而CD34等干細胞特異性表面抗原顯著下調(diào)，THBS1、SELP、CD61、VWF、GP5等與MK細胞分化相關(guān)的基因顯著上調(diào)，這些基因涉及細胞與基質(zhì)及細胞間黏附、細胞周期及發(fā)育、細胞骨架形成及調(diào)控等功能，CCR4等趨化因子及受體、IL6ST和CSF3R等參與免疫反應及其調(diào)控，同時還有大量新陳代謝及信號轉(zhuǎn)導相關(guān)基因明顯差異表達，另外，IRAK2、CAPN2等凋亡相關(guān)基因在MK細胞中表達豐度高于非MK細胞，而BCL2、TNFRSF10D等抑制凋亡的基因表達豐度則低于非MK，表明TPO誘導的凋亡與巨核細胞分化相關(guān)，這與Ryu等[9]的結(jié)果一致。本研究在差異表達的基因中選擇了log2Ratio (MK/非MK)為2.6的THBS1和log2Ratio (MK/非MK)為-10.4的HOXA9進行驗證。THBS1在調(diào)節(jié)細胞的黏附、移行、增生和分化、誘導血小板聚集和抑制血管生成方面發(fā)揮重要作用，在巨核細胞中表達高于非巨核細胞；HOXA9存在于早期造血干/祖細胞，參與造血干/祖細胞分化的調(diào)控；在巨核細胞中表達低于非巨核細胞。

M:Marker;1:巨核細胞；2：非巨核細胞M :Marker; 1: megakaryocyte; 2: non-megakaryocyte

Solexa測序發(fā)現(xiàn)的潛在調(diào)控基因以及未知序列今后仍需要進一步深入的研究，以闡明轉(zhuǎn)錄本增強或降低對巨核細胞增殖和分化過程的影響。

[1] Wall PK, Leebens-Mack J, Chanderbali AS, et al. Comparison of next generation sequencing technologies for transcriptome characterization[J]. BMC Genomics, 2009, 10:347-365.

[2] Chen X, Li Q, Wang J,et al. Identification and characterization of novel amphioxus microRNAs by Solexa sequencing[J]. Genome Biol, 2009, 10(7):R78-R90.

[3] Teng X, Xiao H. Perspectives of DNA microarray and next-generation DNA sequencing technologies[J]. Sci China C Life Sci, 2009, 52(1):7-16.

[4] Morozova O, Marra MA. Applications of next-generation sequencing technologies in functional genomics[J]. Geno- mics, 2008, 92(5):255-264.

[5] Aury JM, Cruaud C, Barbe V,et al. High quality draft sequences for prokaryotic genomes using a mix of new sequencing technologies[J]. BMC Genomics, 2008, 9:603-613.

[6] Bau S, Schracke N, Kr?nzle M,et al. Targeted next-generation sequencing by specific capture of multiple genomic loci using low-volume microfluidic DNA arrays[J]. Anal Bioanal Chem, 2009, 393(1):171-175.

[7] Trick M, Long Y, Meng J, et al.Single nucleotide polymorphism (SNP) discovery in the polyploid Brassica napus using Solexa transcriptome sequencing[J]. Plant Biotechnol J, 2009, 7(4):334-346.

[8] Hanriot L, Keime C, Gay N, et al. A combination of longSAGE with Solexa sequencing is well suited to explore the depth and the complexity of transcriptome[J]. BMC Genomics, 2008, 9:418-426.

[9] Ryu KH, Chun S, Carbonierre S, et al. Apoptosis and megakaryocytic differentiation duringexvivoexpansion of human cord blood CD34+ cells using thrombopoietin[J]. Br J Haematol, 2001, 113(2):470-478.

AnalysisofmRNAExpressionProfilesofMegakaryocytesfromHumanCordBloodCD34+CellsExVivoExpandedUsingSolexaSequencing

WANG Fang, HE Ji, ZHU Fa-ming, LIU Jin-hui, QIN Fei,CHEN Shu, XU Gang, Lü Xing-jun, YAN Li-xing

Blood Center of Zhejiang Province, Key Laboratory of Blood Safety Research, Ministry of Health, Hangzhou 310006, China

YAN Li-xing Tel: 0571-85167801, E-mail: ylx@zjb.org.cn

ObjectiveTo investigate the mRNA expression profiles of megakaryocytes (MKs) from human cord blood CD34+cellsexvivoexpanded using Solexa technique.MethodsCD34+Cells were isolated using density gradient centrifugation and magnetic activated cell sorting. Cultures were stimulated with recombinant human thrombopoietin (100 ng/ml). After 12 days, the MKs fraction was separated from the non-MKs fraction using an anti-CD41 monoclonal antibody by immunomagnetic sorting. The mRNA expression of MKs and non-MKs was detected by Solexa sequencing.ResultsWe obtained 3 773 147 and 3 533 805 Tags from MKs and non-MKs, respectively. The amounts of unambiguous tags were 3 291 132 and 2 967 947 and those of distinct tags were 197 769 and 245 318. The expression of 1161 genes was up-regulated and that of 902 genes down-regulated. The expression of 2717 tags was up-regulated and that of 1519 tags down-regulated.ConclusionsMKs and non-MKs have remarkably different mRNA expression profiles. The differential gene-encoded products may be involved in cellular development, adhesion, apoptosis metabolism, intra- and inter-cellular signal transduction, and immune response. Further studies on this topic may clarify the expression mechanism, signal transduction, and regulation mechanisms.

megakaryocyte; mRNA expression;exvivoexpansion; Solexa sequencing

ActaAcadMedSin, 2011,33(5):529-532

嚴力行 電話：0571-85167801，電子郵件：ylx@zjb.org.cn

R392.12

A

1000-503X(2011)05-0529-04

10.3881/j.issn.1000-503X.2011.05.010

2010-10-29)