趙晶，孟令章，陶鈞，肖瑤，邢文革

分子流行病學(xué)是應(yīng)用先進(jìn)的技術(shù)檢測生物學(xué)標(biāo)志的分布情況，結(jié)合流行病學(xué)現(xiàn)場研究方法，從分子或基因水平闡明疾病的病因及其相關(guān)的致病過程，并研究疾病的防治和促進(jìn)健康的策略和措施的科學(xué)。自1989年美國學(xué)者 Choo等[1]應(yīng)用分子克隆技術(shù)首先發(fā)現(xiàn)丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）以來，HCV的分子生物學(xué)、病毒分型、HCV感染的流行特征及與臨床關(guān)系等方面的研究都取得了很大進(jìn)展。以 HCV的基因分型作為生物標(biāo)志（biomarkers）進(jìn)行的分子流行病學(xué)研究對 HCV 感染、傳播、診斷、治療及預(yù)防等方面均有重要意義。本文就 HCV的分型和分子流行病學(xué)國內(nèi)外研究進(jìn)展等方面進(jìn)行綜述。

1 HCV 分型的研究進(jìn)展

1.1 HCV的分型依據(jù)

HCV 具有顯著異源性和高度可變性。對已知全部基因組序列的HCV 株進(jìn)行分析比較，其核苷酸和氨基酸序列存在較大差異，HCV 基因組各部位的變異程度不相一致，如5’-NCR 最保守，同源性在92%～100%，而 3’-NCR 區(qū)變異程度較高。在HCV的編碼基因中，C 區(qū)最保守，非結(jié)構(gòu)（NS）區(qū)次之，囊膜蛋白 E2/NS1 編碼區(qū)可變性最高，稱為高可變區(qū)。

根據(jù)現(xiàn)有的HCV 分離株數(shù)據(jù)，HCV 基因多樣性主要表現(xiàn)在4個(gè)水平：①HCV 基因組的核苷酸序列變異 31%～33% 時(shí)，定為基因型；②基因組的核苷酸變異 20%～25%定為基因亞型；③HCV 基因組的核苷酸變異超過 10% 定為分離株；④感染者體內(nèi)可同時(shí)存在不同的多種序列組成，但卻有很高同源性（同源性 ≥ 95%）的HCV 變異株群體稱為準(zhǔn)種（quasispecies）[2]。

1.2 HCV 基因分型系統(tǒng)概況

目前至少有 4 種不同的HCV 基因型命名系統(tǒng)[3]，分別為Okomoto 系統(tǒng)、Cha 系統(tǒng)、Kanazawa 系統(tǒng)和Simmonds 系統(tǒng)。1993年Simmonds 依據(jù)不同病毒毒株編碼非結(jié)構(gòu)蛋白 5（NS5）區(qū)域核苷酸序列的同源性，按照發(fā)現(xiàn)的先后將 HCV 分為1～6個(gè)型和11個(gè)主要的亞型，亞型以 a、b、c等表示[4]。該分型方法得到了大多數(shù)學(xué)者的認(rèn)同。該分型法能與先前的各種分型命名法相對應(yīng)，不僅協(xié)調(diào)了以前的分型命名方法，而且可以在多種分型系統(tǒng)中命名新的型和亞型。不同分型系統(tǒng)之間的對應(yīng)關(guān)系見表1。

1.3 HCV 分型方法研究進(jìn)展

目前 HCV 分型有多種方法，如：血清學(xué)分型法、核酸序列分析法、型特異性引物擴(kuò)增分型、型特異探針雜交分型法和限制性長度多態(tài)性分析法（RFLP）等。

表1 HCV 基因型各種分型之間的對應(yīng)關(guān)系

1.3.1 血清學(xué)分型 HCV 血清學(xué)分型技術(shù)是根據(jù) HCV某些區(qū)域表達(dá)抗原具有與基因型對應(yīng)的型別差異，合成特異性多肽作為包被抗原，對 HCV 血清抗體進(jìn)行分型檢測。Murex HCV 血清分型試劑盒針對 HCV NS4 區(qū)的特異性抗體，對 HCV 進(jìn)行血清學(xué)分型。Murex HCV 血清分型實(shí)驗(yàn)雖不能區(qū)分亞型，但其分型結(jié)果對臨床治療具有一定指導(dǎo)作用[5]。

1.3.2 核酸序列分析法 隨著核酸測序技術(shù)的發(fā)展，直接測序分型成為目前具有推廣潛力的HCV 基因型檢測方法。該方法需要對 HCV RNA 進(jìn)行巢式 PCR 擴(kuò)增，它使用兩對引物，進(jìn)行兩次 PCR 反應(yīng)，能夠極大地增加 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)的敏感性和特異性。套式 PCR 第二次反應(yīng)的引物（內(nèi)引物）位于第一次 PCR 擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)。外引物進(jìn)行第一次PCR 擴(kuò)增后，將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至第二次 PCR 反應(yīng)管內(nèi)，使用一對內(nèi)引物進(jìn)行第二次 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，最后用凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物并測序。HCV的核酸序列分析法是 HCV分型中最經(jīng)典、最可靠的分型方法，許多其他的分型方法都將序列分型作為參考標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.3 型特異性引物擴(kuò)增分型 根據(jù)不同 HCV 基因型在某一區(qū)段（主要是保守區(qū)）序列的差異，設(shè)計(jì)一系列型特異性引物。不同 HCV 基因型可擴(kuò)增出長度大小不同的片段，并以此分型。這個(gè)方法是目前國內(nèi)外學(xué)者較為廣泛應(yīng)用的方法。他們分別根據(jù)各自地區(qū)需要區(qū)分的不同型別的HCV 基因序列設(shè)計(jì)了 5’NTR 區(qū)、C 區(qū)、NS5B 區(qū)的特異性引物，將該地區(qū)的基因型及亞型很好地分開。此方法由于不同學(xué)者采用的設(shè)計(jì)引物的基因型不同，設(shè)計(jì)引物的區(qū)域不同，想要進(jìn)行 HCV 基因分型的型別不同，采用的引物和引物數(shù)目各不相同，因此不利于結(jié)果間的比較。

1.3.4 型特異探針雜交分型 通過生物素標(biāo)記的引物擴(kuò)增HCV 病毒基因組中 5’非翻譯區(qū)的保守序列，利用固定于膜上的型特異性探針與擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交，通過互補(bǔ)結(jié)合后，可直接與鏈霉抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶結(jié)合物結(jié)合，再通過底物作用而在相應(yīng)的探針位置出現(xiàn)雜交信號，即可以此進(jìn)行結(jié)果判斷[6]。該方法敏感性高、特異性強(qiáng)、雜交信號明顯、結(jié)果易判斷，且能區(qū)分多種基因型，是較為理想、方便、實(shí)用的分型方法。

應(yīng)用此原理的目前較廣泛使用的是 LiPA HCV 基因分型 2.0 試劑盒。相比第一代產(chǎn)品，二代 LiPA HCV 增加了核心區(qū)序列，可準(zhǔn)確地區(qū)分 1a和1b 型，并可避免東南亞地區(qū)和我國南部地區(qū)較常見的6c-6l 型被誤分為1 型，但仍約有 8%的2a 型易被誤判為1a 型，而這兩種型別的HCV 感染的治療和預(yù)后均存在較大差異。需要注意，LiPA要經(jīng)過 PCR 擴(kuò)增，對 HCV 混合感染進(jìn)行分型時(shí)，不可避免會(huì)因不同型別 RNA 擴(kuò)增效率不一造成的劣勢擴(kuò)增毒株的漏檢。

1.3.5 限制性長度多態(tài)性分析法（restriction fragment length polymorphisms，RFLP） HCV 不同基因型某一區(qū)段個(gè)別堿基的變異可直接導(dǎo)致某些酶切位點(diǎn)的改變。RFLP 法一般選 5’NTR 區(qū)和NS5B 區(qū)作為RFLP 分型的靶基因。PCR 擴(kuò)增靶基因得到的產(chǎn)物用不同的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，不同型或亞型得到不同長度大小的片段，然后根據(jù)酶切后電泳所表現(xiàn)的片段大小及多態(tài)性進(jìn)行基因分型。

2 HCV 分子流行病學(xué)研究進(jìn)展

2.1 HCV 基因型的地區(qū)分布特征

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 HCV 有 6 種基因型和上百種基因亞型。研究表明，HCV 基因亞型的分布與地區(qū)有關(guān)。1a、1b、2a、2b和3a 呈世界性分布，造成絕大多數(shù)的HCV 感染[7]。圖 1 展示了 20 世紀(jì)部分國家和地區(qū)的HCV 流行的主要基因型或亞型[2]。圖中 1a亞型流行于北歐、美國；1b亞型廣泛分布于世界各個(gè)地區(qū)；2 型分布于地中海、東亞；3 型主要分布于歐洲；4 型分布于中東；5 型廣泛分布于南非；6 型主要分布于中國香港、越南、澳大利亞。

按照地理位置由西向東，對近年來 HCV 基因亞型的地區(qū)分布的研究進(jìn)展總結(jié)如下：西方國家共同的基因型 1 型（1a、1b）和2 型（2a、2b、2c）在過去的50～70年廣泛分布于歐洲和北美洲，目前 1 型（1a、1b）仍為西歐和美國的主要亞型。地中海巴爾干半島 1b亞型最高，同中歐、西歐的臨界國情況相同，但是希臘除外（3a亞型最多）[8]。非洲的流行情況為：西非主要流行 2 型；中非（剛果共和國、加蓬共和國等）主要流行 1 型、4 型；北非（埃及）主要流行 4 型[9-12]。中東地區(qū)：阿拉伯國家主要流行 4 型，然而非阿拉伯國家主要流行 1a和1b 兩種亞型[13]。亞洲國家以 1b亞型為主，2a亞型次之。東南亞主要流行 3 型和6 型。需要特別說明的是：撒哈拉以南非洲和東南亞 HCV亞型多樣化，且出現(xiàn)較多的HCV亞型重組（原因可能為反復(fù)共用針具吸毒等）。由于基因亞型檢測方法的局限，通常檢測出的亞型為感染者體內(nèi)的占優(yōu)勢的亞型。因此，對于如撒哈拉以南非洲和東南亞 HCV亞型多樣化的地區(qū)，亞型檢測不能準(zhǔn)確描述個(gè)體的感染狀況，而且在流行病學(xué)上的意義比較小。

圖1 20 世紀(jì)部分國家和地區(qū)的HCV 流行的主要基因型或亞型

圖2 HCV 數(shù)據(jù)庫收錄的中國 HCV 序列亞型構(gòu)成比

對于中國 HCV 基因亞型的研究，以往諸多資料表明以1b和2a 兩種亞型為主。近年來研究顯示，在我國南方廣西、武漢、貴州等省市吸毒人群中，6a亞型為主要亞型。圖 2 展示了 HCV 數(shù)據(jù)庫截止到 2010年7 月收錄的中國 HCV 序列亞型的構(gòu)成比[14]。根據(jù)數(shù)據(jù)庫的說明，此圖不能代表 HCV 各亞型在中國分布的真實(shí)構(gòu)成比，但是在一定程度上可以反映出中國 HCV 基因型和亞型分布的概況。

2.2 HCV 基因型的時(shí)間分布特征

HCV 基因組突變率以（1.5～2.0）×10-3/（堿基×年）來算，HCV 基因型、亞型分別于500～2000年和100～300年前形成。根據(jù)各亞型進(jìn)化的基因距離推論，1b亞型和2 型的進(jìn)化時(shí)間較長，是古老的亞型，其他亞型進(jìn)化時(shí)間較短。諸多研究結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的推移，1b亞型和2 型有逐漸被其他亞型取代的趨勢，如：巴基斯坦的3a亞型在20 世紀(jì) 20年代出現(xiàn)，在50年代開始快速增長；在法國 1983年后才出現(xiàn) 3 型，現(xiàn)在已成為該國的流行亞型，最近該國又出現(xiàn) 4 型和1a亞型大幅度上升而 lb亞型和2 型下降的現(xiàn)象；塞爾維亞的研究中，小于40 歲的年齡組3 型所占比例顯著多于40 歲以上年齡組，且顯示隨時(shí)間推移 1b亞型所占比例降低；澳大利亞一篇研究匯總了 1996–1998年3年的亞型分布研究，可以看出1 型構(gòu)成比例有降低的趨勢，4 型有升高的趨勢[15]。

近幾十年，相對新的感染途徑導(dǎo)致 HCV的快速傳播[16-17]，如 20 世紀(jì) 40年代的不潔采血、共用注射器吸毒、用未經(jīng)消毒的針頭進(jìn)行注射和接種疫苗。這可能是 HCV 基因亞型變化的內(nèi)在根源，因?yàn)檠芯匡@示感染途徑與亞型密切相關(guān)。在我國，有關(guān) HCV 流行史的研究較少。隨著感染時(shí)間的推移，人口的流動(dòng)，主要感染途徑的變化，HCV 基因亞型在我國的流行應(yīng)該呈現(xiàn)出一定的變化趨勢。HCV 分子流行病學(xué)的研究能夠揭示 HCV 在我國流行的過程，從而對HCV的防控措施和疫苗的研究提供重要的依據(jù)。

2.3 HCV 基因型的人群分布特征

近年來對 HCV 傳播途徑的認(rèn)識越來越清晰，大量的研究已證實(shí)，lb、2 型、5 型與輸血、血制品或醫(yī)院內(nèi)傳播有關(guān)，3a、1a、4 型、6 型與靜脈吸毒（IDU）關(guān)系密切，而其他傳播途徑與HCV 基因型間無明顯相關(guān)性[18]。其他研究表明：西方國家傳播途徑主要有經(jīng)血傳播、IDU、介入性治療及手術(shù)；比利時(shí)的一項(xiàng)研究報(bào)道了如醫(yī)療職業(yè)暴露、紋身、有創(chuàng)身體裝飾、母嬰等傳播途徑；Okamoto 報(bào)告日本血友病患者約 50% 為1a亞型感染，原因是輸入美國進(jìn)口凝血因子 VIII；塞爾維亞的一項(xiàng)研究報(bào)道，腎透析病人和有很長 HCV 感染史的病人 HCV 不同基因型、亞型間的混合感染非常多[19]。

近年來諸多研究表明 IDU人群 HCV 感染率非常高，需要引起重視。Aceijas等[20]匯總了 1998–2005年的有關(guān)于IDU人群 HCV 感染的文獻(xiàn)，包括了 57個(gè)國家，152個(gè)地區(qū)。HCV 感染率分別為：東歐中亞 10%～96%；南亞東南亞 10%～100%；東亞和太平洋 34%～93%；北非中東5%～60%；拉美 2%～100%；北美 8%～90%；澳大利亞、新西蘭 25%～88%；西歐 2%～93%；只有哥倫比亞和黎巴嫩低于20%；中國、波蘭、波多黎各、俄羅斯、西班牙、瑞士、泰國、越南的IDU人群 HIV/HCV 共感染率為90%。另有對中國 1997 - 2006年間的105 篇關(guān)于IDU人群 HCV 患病率研究的分析結(jié)果顯示，中國 IDU人群的HCV 患病率為61.4%，感染最嚴(yán)重的省份和自治區(qū)為：湖北、云南、廣西壯族自治區(qū)、湖南和新疆維吾爾自治區(qū)[21]。以上數(shù)據(jù)充分說明了對 IDU人群進(jìn)行 HCV 普查的必要性，特別是 HIV 陽性的IDU人群。

3 HCV 分子流行病研究對于臨床的意義

不同基因型對抗病毒治療的應(yīng)答不同，采取的治療方案也不同，因此，基因型的測定有助于決定抗病毒療程和藥物劑量。根據(jù)臨床研究結(jié)果，在1 型患者中建議療程為1年，利巴韋林的用量要達(dá)到 1000～1200 mg/d，但是其持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答（sustained virologic response，SVR）僅達(dá)到 40%～45%；而 2和3 型患者，療程半年，利巴韋林的用量只要800 mg/d 即可達(dá)到 70%～80%的SVR，延長療程或增加利巴韋林的用量都不能進(jìn)一步提高持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答率。根據(jù)不同的基因型調(diào)整療程和利巴韋林的用藥劑量，可以減少藥物的浪費(fèi)，減輕藥物的不良反應(yīng)，從而提高患者對治療的依從性。

[1]Choo QL, Kuo G, Weiner AJ, et al.Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome.Science,1989, 244(4902):359-362.

[2]Simmonds P, Bukh J, Combet C, et al.Consensus proposals for a uni fi ed system of nomenclature of hepatitis C virus genotypes.Hepatology, 2005, 42(4):962-973.

[3]Gao YH, Li Z, Tai H.The research progress of HCV genotyping method.Int J Lab Med.2006, 27(10):908-910.(in Chinese)高玉紅, 李崢, 臺虹.丙型肝炎病毒基因分型方法研究進(jìn)展.國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2006, 27(10):908-910.

[4]Huang HJ.Medical microbiology.Beijing: Higher Education Press,2009.(in Chinese)黃漢菊.醫(yī)學(xué)微生物學(xué).北京: 高等教育出版社, 2009.

[5]Xu WS, Wang L, Geng DY, et al.The application and evaluation of murex HCV genotyping assay.Sect Clin Biochem & Lab Med Foreign Med Sci, 2005, 26(7):473-475.(in Chinese)徐皖蘇, 王磊, 耿大影,等.Murex丙型肝炎病毒血清分型試劑應(yīng)用及其評價(jià).國外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊, 2005, 26(7):473-475.

[6]Zhang TH, Zhang CP, Zhang GY, et al.DNA chip: principle of fabrication and detection of hybridization signals.Prog Bioeng, 2000,20(2):64-68, 75.(in Chinese)張?zhí)旌? 張春平, 張光寅,等.DNA芯片制作原理及其雜交信號檢測方法.生物工程進(jìn)展, 2000, 20(2): 64-68, 75.

[7]Mondelli MU, Silini E.Clinical signi fi cance of hepatitis C virus genotypes.J Hepatol 1999, 31 suppl 1:65-70.

[8]Stamenkovic G, Zerjav S, Velickovic ZM, et al.Distribution of HCV genotypes among risk groups in Serbia.Eur J Epidemiol, 2000, 16(10):949-954.

[9]Jeannel D, Fretz C, Traore Y, et al.Evidence for high genetic diversity and long-term endemicity of hepatitis C virus genotypes 1 and 2 in West Africa.J Med Virol, 1998, 55(2):92-97.

[10]Mellor J, Holmes EC, Jarvis LM, et al.Investigation of the pattern of hepatitis C virus sequence diversity in different geographical regions:implications for virus classification.The International HCV Collaborative Study Group.J Gen Virol, 1995, 76(Pt 10):2493-2507.

[11]Wansbrough-Jones MH, Frimpong E, Cant B, et al.Prevalence and genotype of hepatitis C virus infection in pregnant women and blood donors in Ghana.Trans R Soc Trop Med Hyg, 1998, 92(5):496-499.

[12]Ruggieri A, Argentini C, Kouruma F, et al.Heterogeneity of hepatitis C virus genotype 2 variants in West Central, Africa (Guinea Conakry).J Gen Virol, 1996, 77(Pt 9):2073-2076.

[13]Ramia S, Eid-Fares J.Distribution of hepatitis C virus genotypes in the Middle East.Int J Infect Dis, 2006, 10(4):272-277.

[14]Kuiken C, Yusim K, Boykin L, et al.The Los Alamos hepatitis C sequence database.Bioinformatics, 2005, 21(3):379-384.

[15]Dore GJ, Law M, MacDonald M, et al.Epidemiology of hepatitis C virus infection in Australia.J Clin Virol, 2003, 26(2):171-184.

[16]Ndjomou J, Pybus OG, Matz B.Phylogenetic analysis of hepatitis C virus isolates indicates a unique pattern of endemic infection in Cameroon.J Gen Virol, 2003, 84(Pt 9):2333-2341.

[17]Simmonds P.The origin and evolution of hepatitis viruses in humans.J Gen Virol 2001, 82(Pt 4):693-712.

[18]Zhong HP, Zhao W, Shen L.The epidemical and clinical significance of HCV genotype.World J Infect, 2007, 7(2):97-101.(in Chinese)鐘華平, 趙偉, 沈玲.HCV基因型在流行病和臨床上的意義.世界感染雜志, 2007, 7(2):97-101.

[19]Stamenkovic G, Zerjav S, Velickovic ZM, et al.Distribution of HCV genotypes among risk groups in Serbia.Eur J Epidemiol, 16(10):949-954.

[20]Aceijas C, Rhodes T.Global estimates of prevalence of HCV infection among injecting drug users.Int J Drug Policy, 2007, 18(5):352-358.

[21]Xia X, Luo J, Bai J, et al.Epidemiology of hepatitis C virus infection among injection drug users in China: systematic review and meta-analysis.Public Health, 2008, 122(10):990-1003.