鐘連聲，齊華文，潘忠誠(chéng)，馬汝海，何群，姜雪，趙雨杰

隨著人類基因組學(xué)研究的不斷進(jìn)展，基因芯片正逐步成為檢測(cè)基因表達(dá)最強(qiáng)大的分子生物學(xué)技術(shù)方法。其中寡核苷酸探針芯片制備比較容易，相對(duì)成本較低，并且特異性強(qiáng)。各個(gè)位點(diǎn)間的變異比較小，雜交后結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性比長(zhǎng)探針芯片好。

目前美國(guó) affymatrix公司和國(guó)內(nèi)一些研究機(jī)構(gòu)多使用 25-mer 寡核苷酸（Oligo）探針制作基因芯片。盡管寡核苷酸芯片具有很多優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用也越來(lái)越廣泛，但科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，基因芯片雜交結(jié)果的重現(xiàn)性仍然不是十分理想。Zhang等[1]研究表明近70% 檢測(cè)相同基因的探針陣列點(diǎn)雜交信號(hào)數(shù)值出現(xiàn)明顯偏差。很多學(xué)者認(rèn)為：除了基因芯片設(shè)計(jì)和制備因素以外，最重要的原因是基因芯片雜交過(guò)程的特殊性造成的。因?yàn)榛蛐酒s交是在固-液界面完成的，與溶液中的核酸雜交不同，探針及靶分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)對(duì)芯片的雜交結(jié)果產(chǎn)生影響。鑒于此，我們?cè)O(shè)計(jì)了一組具有不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的探針和靶分子，以探討不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的探針和靶分子對(duì)基因芯片雜交過(guò)程的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

探針及靶分子均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。OWLS 1.20 及傳感器芯片為匈牙利Micro Vacuum公司產(chǎn)品；Gene TACTMLS IV 熒光圖像掃描儀為美國(guó) Gnomic Solutions公司產(chǎn)品；202-0 數(shù)顯電熱恒溫干燥箱為上海陽(yáng)光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品。硅烷偶聯(lián)劑 SCA-1103（3-氨丙基三甲氧基硅烷）購(gòu)自國(guó)泰華榮化工新材料有限公司；戊二醛購(gòu)自美國(guó) Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 探針及靶分子的設(shè)計(jì) 為了系統(tǒng)研究二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)芯片雜交過(guò)程的影響，應(yīng)用二級(jí)結(jié)構(gòu)分析軟件 Mfold 分別設(shè)計(jì)了 3 對(duì) 25-mer 完全互補(bǔ)的具有不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的探針和靶分子（P0T0、P3T3、P4T4），以及1 對(duì)尾端有 2個(gè)堿基錯(cuò)配的探針和靶分子（P4T3），其序列見(jiàn)表1（下劃線示莖環(huán)結(jié)構(gòu)的干）。其中 P0T0完全互補(bǔ)，Tm值小于20 ℃，說(shuō)明其在37 ℃ 溶液中不會(huì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)；P3T3和P4T4也完全互補(bǔ)，但 P3T3形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)含有 3 bp的莖、5 bp的環(huán)和2個(gè)長(zhǎng)分別為4 bp和10 bp的尾巴，P4T4形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)含有 4 bp的莖、10 bp的環(huán)和1個(gè) 6 bp的尾巴（圖 1）；而 P4T3含有 2個(gè)末端的不匹配堿基（A·A、C·C）。

表1 探針和靶分子的序列Table1 Sequence of target molecules and probes

圖1 探針和靶分子（P0T0、P3T3、P4T4）在溶液中的二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖Figure1 The secondary structure of probes and target molecules (P0T0, P3T3, P4T4) in solution

1.2.2 醛基化傳感器芯片的制備 將傳感器芯片放入重鉻酸鉀硫酸洗液中浸泡 10 min，1 mol/L NaOH 浸泡 1 h，無(wú)水乙醇沖洗脫水；2.5%的硅烷偶聯(lián)劑浸泡 10 min，入烘箱 104 ℃ 烘烤 1 h；2.5% 戊二醛浸泡 4 h，吹干備用。

1.2.3 探針和靶分子溶液的制備 將各探針和靶分子分別溶于含有 0.12 mol/L MgCl2、0.01 mol/L Tris·HCl的混合溶液（pH 7.6）中，調(diào)整探針的終濃度分別為1、2、5、10、20 μmol/L，靶分子的終濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 μmol/L，并以 Cy5 標(biāo)記靶分子。

1.2.4 最佳雜交條件分析 實(shí)驗(yàn)所用溶液都經(jīng)過(guò)100 ℃ 加熱 30 min和超聲 10 min 處理，以去除溶液中溶解的氣體。

1.2.4.1 最佳雜交探針濃度 取各濃度探針 2 μl固定在醛基化傳感器芯片中央，37 ℃ 溫箱中孵育1 h，置于含有 0.12 mol/L MgCl2、0.01 mol/L Tris·HCl的混合溶液（pH 7.6）中浸泡過(guò)夜后，安裝至 OWLS上。用含有 0.12 mol/L MgCl2、0.01 mol/L Tris·HCl的混合溶液（pH 7.6）為載液沖洗傳感器芯片至基線水平（NTM和NTE 模式導(dǎo)數(shù)小于10-8/s），流速為1 μl/min。將濃度為5 μmol/L的Cy5 標(biāo)記靶分子 120 μl 注入 OWLS的加樣環(huán)（容積為100 μl）中雜交 1 h。用熒光圖像掃描儀進(jìn)行掃描，檢測(cè)各濃度探針雜交后熒光信號(hào)強(qiáng)度，確定最佳雜交探針濃度。

1.2.4.2 最佳雜交靶分子濃度 以最佳雜交探針濃度構(gòu)建芯片，分別將各濃度 Cy5 標(biāo)記的靶分子溶液注入 OWLS，雜交 1 h。用熒光圖像掃描儀進(jìn)行掃描，檢測(cè)各濃度靶分子雜交后熒光信號(hào)強(qiáng)度。

1.2.5 傳感器芯片質(zhì)量驗(yàn)證 將已醛基化的傳感器芯片安裝在OWLS 上，用含有 0.12 mol/L MgCl2、0.01 mol/L Tris·HCl的混合溶液（pH 7.6）沖洗芯片120 min，流速保持為1 μl/min。將 10 μmol/L 探針注入 OWLS的加樣環(huán)，待基線平穩(wěn)后將 1 μmol/L靶分子注入加樣環(huán)，OWLS 監(jiān)測(cè)傳感器芯片表面質(zhì)量變化。

1.2.6 傳感器芯片的化學(xué)法再生 選取 0.4%SDS和0.1% NaOH 分別處理雜交后的傳感器芯片 10、20、30、60 min，用熒光圖像掃描儀進(jìn)行掃描，檢測(cè)雜交后熒光信號(hào)強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 5 次。

1.2.7 雜交復(fù)合物質(zhì)量與雜交效率測(cè)定 為避免與探針結(jié)合而降低靶分子濃度，確保其濃度穩(wěn)定，將靶分子進(jìn)樣速度分別控制在15 μl/h、180 μl/h，并依次在雜交 7 h、0.5 h 后沖洗，以 OWLS 測(cè)定完全雜交后芯片表面探針與靶分子結(jié)合形成的雜交復(fù)合物的質(zhì)量；測(cè)定固定時(shí)間內(nèi)各雜交復(fù)合物的雜交效率，即計(jì)算芯片表面結(jié)合的靶分子質(zhì)量占芯片表面結(jié)合的探針質(zhì)量的百分比；并用 Curve Expert 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 最佳雜交條件

2.1.1 探針濃度的選擇 將濃度為1、2、5、10、20 μmol/L的探針固定于芯片表面，加入 5 μmol/L Cy5 標(biāo)記的靶分子進(jìn)行雜交 1 h，熒光圖像掃描結(jié)果顯示探針濃度為5 μmol/L 時(shí)，芯片雜交熒光信號(hào)達(dá)到飽和（圖 2）。為保證芯片表面探針數(shù)量達(dá)到飽和，后續(xù)實(shí)驗(yàn)我們采用了濃度為10 μmol/L的探針構(gòu)建芯片。

圖2 不同濃度探針與5 μmol/L 靶分子雜交的熒光掃描Figure2 The hybridization fluorescence image of different concentrations of probes and 5 μmol/L target molecule

圖3 10 μmol/L 探針與不同濃度靶分子雜交的熒光掃描Figure3 The hybridization fluorescence image of 10 μmol/L probe and different concentrations of target molecules

2.1.2 靶分子濃度的選擇 以濃度為10 μmol/L的探針構(gòu)建芯片后，分別加入濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 μmol/L的Cy5 標(biāo)記的靶分子雜交 1 h，熒光圖像掃描結(jié)果顯示靶分子濃度為1 μmol/L 時(shí)，芯片雜交熒光信號(hào)達(dá)到飽和（圖 3）。

2.2 傳感器芯片質(zhì)量驗(yàn)證

以 OWLS 實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)醛基化傳感器芯片表面探針與靶分子的雜交過(guò)程，在A 點(diǎn)加入探針，在B點(diǎn)開(kāi)始沖洗，待基線穩(wěn)定后在C 點(diǎn)加入靶分子，D點(diǎn)沖洗，建立結(jié)合模型（圖 4）。

將與探針完全互補(bǔ)的熒光標(biāo)記靶分子滴入已固定探針的傳感器芯片與之進(jìn)行雜交，熒光圖像掃描結(jié)果顯示雜交熒光信號(hào)非常清晰（圖 5A）；而將與探針完全不互補(bǔ)的熒光標(biāo)記靶分子滴入傳感器芯片與之進(jìn)行雜交，熒光圖像掃描結(jié)果顯示無(wú)雜交熒光信號(hào)（圖 5B），說(shuō)明傳感器芯片構(gòu)建成功。

圖4 OWLS 實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)傳感器芯片表面探針（10 μmol/L）與靶分子（1 μmol/L）的雜交過(guò)程（A：加入探針；B：沖洗；C：加入靶分子；D：沖洗）Figure4 Monitored the hybridization process of probe (10μmol/L) and target molecule (1 μmol/L) on the sensor chip surface.(A: Injected probe; B: Washing; C: Injected target molecule; D: Washing)

圖5 探針與靶分子雜交的熒光圖像掃描結(jié)果（A：探針與靶分子完全互補(bǔ)；B：探針與靶分子完全不互補(bǔ)）Figure5 The hybridization fluorescence image of probe and target molecule.(A: Probe completely matched with target molecule; B: Probe completely mismatched with target molecule)

表2 雜交不同時(shí)間后形成的雜交復(fù)合物質(zhì)量與雜交效率Table2 The quality of the complexes and the efficiency of hybridization for different time

2.3 傳感器芯片的最佳再生條件

選取了 2 種芯片再生方法：0.4% SDS和0.05% NaOH。將雜交后芯片分別浸入上述 2 種溶液中 10、20、30、60 min。熒光圖像掃描結(jié)果顯示，用 0.05% NaOH 處理 30 min 即可達(dá)到芯片再生的目的，且重復(fù) 5 次后的雜交熒光信號(hào)強(qiáng)度依然沒(méi)有明顯改變，表明芯片具有再生穩(wěn)定性，至少可以重復(fù)使用 5 次。

2.4 雜交復(fù)合物質(zhì)量與雜交效率

將靶分子進(jìn)樣速度控制在15 μl/h，雜交 7 h后，OWLS 檢測(cè)結(jié)果顯示芯片表面形成的P0T0、P3T3、P4T4、P4T3雜交復(fù)合物的質(zhì)量都在40～45 ng/cm2之間，相當(dāng)于每 100 nm2芯片面積上結(jié)合了 3個(gè)靶分子；但完全不互補(bǔ)的P0T4雜交復(fù)合物的質(zhì)量為0，說(shuō)明與探針?lè)翘禺愋越Y(jié)合的靶分子可被完全洗掉。將靶分子進(jìn)樣速度控制在180 μl/h，雜交 0.5 h 后，OWLS 檢測(cè)結(jié)果顯示芯片表面形成的P0T0、P3T3、P4T4、P4T3雜交復(fù)合物的質(zhì)量分別為30、20、13、18 ng/cm2（表 2）。

用 Curve Expert 軟件對(duì)雜交 7 h 后OWLS所得數(shù)據(jù)進(jìn)行曲線擬合分析，4組探針與靶分子的雜交過(guò)程均符合朗繆爾一級(jí)方程（相關(guān)系數(shù) R ＞0.98）：M(t)=Mmax{1－exp[–(K×C×t)]}，式中Mmax為探針與靶分子形成的雜交復(fù)合物的最大質(zhì)量；K 為反應(yīng)速率常數(shù)；C 為靶分子濃度。由此方程可得出4組探針與靶分子雜交結(jié)合的K值（表 3）。

表3 雜交7h后探針與靶分子雜交結(jié)合反應(yīng)速率常數(shù)（K）Table3 The reaction rate constants of probes and target molecules hybridization for 7 h (K)

3 討論

隨著基因芯片雜交機(jī)制研究越來(lái)越深入，研究者們發(fā)現(xiàn)探針及靶分子的互補(bǔ)程度、pH 值、離子強(qiáng)度、溫度等是影響芯片雜交的重要因素。但在上述條件都相同的前提下，芯片的雜交效率也不盡相同。對(duì)此，我們分析探針及靶序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)可能是影響芯片雜交的另一重要因素，并在本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用 OWLS 實(shí)時(shí)分析了探針及靶分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)芯片雜交效率的影響。

Gao等[2]學(xué)者認(rèn)為隨著探針和靶分子二級(jí)結(jié)構(gòu)的增加，即使是完全雜交，形成的雜交復(fù)合物質(zhì)量也會(huì)降低。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，只要雜交時(shí)間足夠長(zhǎng)，完全雜交后，無(wú)論探針和靶分子有何種莖環(huán)結(jié)構(gòu)，最終在芯片表面形成的雜交復(fù)合物質(zhì)量都是一定的。分析其原因可能是探針與靶分子雜交后，原有的二級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，進(jìn)而降低了由特殊二級(jí)結(jié)構(gòu)帶來(lái)的空間位阻。但隨著探針和靶分子二級(jí)結(jié)構(gòu)的增加，沒(méi)有特殊二級(jí)結(jié)構(gòu)的P0T0雜交速率常數(shù)為0.465×105L/(mol·s)，而 P4T4的雜交速率常數(shù)為0.081×105L/(mol·s)，雜交速率顯著降低，對(duì)原有二級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞過(guò)程可能是降低雜交速率的主要因素。此外，在3′ 末端出現(xiàn)的2個(gè)堿基的錯(cuò)配也會(huì)影響雜交速率，這可能是因解離常數(shù)增大導(dǎo)致的。

但在一定時(shí)間內(nèi)（0.5 h），隨著莖環(huán)結(jié)構(gòu)中莖和環(huán)堿基數(shù)目的增多，尾巴堿基數(shù)目的減少，雜交所需要的時(shí)間延長(zhǎng)，雜交效率降低；而隨著莖環(huán)結(jié)構(gòu)中莖和環(huán)堿基數(shù)目的減少，尾巴堿基數(shù)目的增多，雜交所需要的時(shí)間縮短，雜交效率升高。其原因可能是特殊的二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)增加空間位阻，進(jìn)而使反應(yīng)速率降低。莖環(huán)結(jié)構(gòu)中尾巴堿基的數(shù)目也是影響雜交的另一因素，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以看出尾巴越長(zhǎng)，雜交效率越高，其原因可能是隨著尾巴堿基數(shù)目的增加，探針和靶分子結(jié)合的概率也就越大，進(jìn)而加快了雜交效率。在3′ 末端出現(xiàn)的2個(gè)堿基的錯(cuò)配會(huì)略微影響雜交的效率，但不及特殊二級(jí)結(jié)構(gòu)帶來(lái)的影響大。由此提示在進(jìn)行基因芯片探針設(shè)計(jì)時(shí)，要避免二級(jí)結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)；在不可避免的情況下，要盡量增加尾巴堿基的數(shù)目。而在探針 3′末端出現(xiàn)少量的堿基錯(cuò)配，并不會(huì)很明顯地影響探針與靶分子的雜交。

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用非標(biāo)記手段研究基因芯片雜交過(guò)程的方法主要是 SPR（surface plasmon resonance）技術(shù)[3-5]。但 SPR 技術(shù)是通過(guò)巰基將探針固定在金表面，進(jìn)而檢測(cè)金表面探針結(jié)合靶分子的質(zhì)量，這與國(guó)內(nèi)外常用的基因芯片不同，不能完全模擬基因芯片的雜交過(guò)程。OWLS 所使用的傳感器與常見(jiàn)的基因芯片一致，通過(guò)探針上的醛基與基因芯片表面的氨基結(jié)合固定探針，可以實(shí)現(xiàn)非標(biāo)記、實(shí)時(shí)、定量檢測(cè)傳感器芯片表面結(jié)合物質(zhì)的質(zhì)量。但目前 OWLS 主要被用來(lái)檢測(cè)蛋白與蛋白之間的相互作用，用其檢測(cè) DNA 之間相互作用的研究還未見(jiàn)報(bào)道。另外，根據(jù)具有特殊結(jié)構(gòu) DNA能與金屬離子相結(jié)合的特性，設(shè)計(jì)不同的探針，還可以應(yīng)用 OWLS 對(duì)溶液中 Cu2+、Zn2+等離子進(jìn)行定量分析。

綜上，本研究應(yīng)用 OWLS 建立了一種可以檢測(cè)基因芯片雜交過(guò)程的新方法，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因芯片表面探針與靶分子結(jié)合形成雜交復(fù)合物的質(zhì)量進(jìn)行實(shí)時(shí)、定量的檢測(cè)，證實(shí)了探針及靶分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)也是影響芯片雜交的另一重要因素，為研究固-液界面 DNA 之間的雜交過(guò)程提供了一個(gè)新的技術(shù)平臺(tái)。

[1]Zhang L, Yoder SJ, Enkemann SA.Identical probes on different high-density oligonucleotide microarrays can produce different measurements of gene expression.BMC Genomics, 2006, 7:153.

[2]Gao Y, Wolf LK, Georgiadis RM.Secondary structure effects on DNA hybridization kinetics: a solution versus surface comparison.Nucleic Acids Res, 2006, 34(11):3370-3377.

[3]Kick A, B?nsch M, Katzschner B, et al.DNA microarrays for hybridization detection by surface plasmon resonance spectroscopy.Biosens Bioelectron, 2010, 26(4):1543-1547.

[4]Bishop J, Chagovetz AM, Blair S.Kinetics of multiplex hybridization:mechanisms and implications.Biophys J, 2008, 94(5):1726-1734.

[5]Yu F, Yao D, Knoll W.Oligonucleotide hybridization studied by a surface plasmon diffraction sensor (SPDS).Nucleic Acids Res, 2004,32(9):e75.