龍石銀，張彩平，高細強，喬新惠，黃良珠，佟 麗，陳武哲，田 英

二苯乙烯苷(2，3，5，4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside，TSG)是從中藥何首烏中提取分離得到的一種含多酚結(jié)構(gòu)的水溶性活性成分，具有抗氧化、抗炎、降脂、改善內(nèi)皮細胞功能、抑制動脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)等作用［1-4］，但分子機制尚未明確。核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)是與炎癥反應、細胞增殖和凋亡等密切相關轉(zhuǎn)錄因子，在細胞靜息狀態(tài)下與NF-κB抑制因子(inhibitor of NF-κB，IκB)結(jié)合形成復合物，NF-κB/IκB途徑被認為是炎癥及凋亡信號轉(zhuǎn)導的關鍵［5-6］，TSG是否能通過調(diào)節(jié)NF-κB/IκB途徑抑制血管內(nèi)皮細胞凋亡尚未見文獻報道。因此，本實驗采用過氧化氫(H2O2)誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡，觀察TSG對凋亡內(nèi)皮細胞的作用及對NF-κB/IκB表達的影響，初步探討TSG保護內(nèi)皮功能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 人臍靜脈內(nèi)皮細胞株HUVECs(編號:C-003-5C)購自中國科學院細胞生物學研究所上海細胞庫。TSG為中國藥品生物制品檢定所產(chǎn)品(編號:110844-200908)。RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，MTT、胰蛋白酶、DMSO均購自Amresco公司，蛋白裂解液和Hoechst 33258熒光染色液購自碧云天生物技術研究所。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自MBI公司，抗NF-κB p65、IκB、GAPDH 抗體購自博士德生物工程有限公司，其余均為分析純級試劑。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組 人臍靜脈內(nèi)皮細胞用含10%胎牛血清的 RPMI 1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2、95%飽和濕度條件下培養(yǎng)。實驗分為3組:①空白對照組;② H2O2組:以 300 μmol·L-1H2O2誘導內(nèi)皮細胞凋亡;③ TSG組:10 μmol·L-1TSG預處理 24 h 后，再加 300 μmol·L-1H2O2孵育 24 h。

1.3 Hoechst 33258染色觀察內(nèi)皮細胞凋亡形態(tài)取對數(shù)生長期細胞，按實驗分組給予不同因素處理后，每孔用4%多聚甲醛500 μl于 4℃固定過夜，PBS清洗3遍后，每孔加入500 μl終濃度為10 mg·L-1的 Hoechst 33258，37℃避光搖床上振蕩30 min，熒光顯微鏡觀察、攝片。

1.4 MTT檢測細胞增殖活力 取對數(shù)生長期的細胞，按分組要求給予不同的處理因素，每組設6個平行復孔。培養(yǎng)24 h后，每孔加5 g·L-1的MTT 20 μl培養(yǎng)4h后棄上清，加DMSO 150 μl/孔，待紫色結(jié)晶完全溶解后，用酶標儀在波長490 nm處測定吸光度值，細胞增殖率/%=試驗組OD/對照組OD×100%。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 TSG處理細胞24 h后，用0.25%的胰蛋白酶消化貼壁細胞，離心，去上清，PBS漂洗2遍，加入冰預冷的75%的乙醇固定，4℃過夜，PI單染檢測細胞凋亡率。

1.6 RT-PCR檢測NF-κB、IκB基因的表達 收集各組細胞，用TRIzol試劑提取各組細胞總RNA，鑒定RNA完整性及純度。各組分別取5μg總RNA，按照MBI公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，cDNA產(chǎn)物于 -20℃保存。GAPDH上游引物為5′-TGTCGCTGTTGAAGTCAGAG-3′，下 游 引 物 為 5′-TCACCATCTTCCAGGAGCGAG-3′，退火溫度 60.0℃，產(chǎn)物長度648 bp;NF-κB上游引物為5′-GGACCAGCAAAGGTTATTGTTC-3′，下 游 引 物 為 5′-TTATACACGCCTCTGTCATTCG-3′，退火溫度 57.8 ℃，產(chǎn)物長度 217 bp;IκB 上游引物為 5′-TCACCAACCAGCCAGAAAT-3′，下游引物為 5′-CATCAGCACCCAAGGACAC-3′，退火溫度 60.0℃，產(chǎn)物長度 267 bp。PCR反應參數(shù)為:94℃預變性4min，94℃變性30s，退火30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)后，72℃延伸10 min，4℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)拍照并對DNA目的條帶進行掃描，以GAPDH為內(nèi)參，分析各基因相對表達水平。

1.7 Western blot檢測蛋白的表達 收集各組細胞，用細胞裂解液裂解細胞后提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白質(zhì)含量。每組取60μg蛋白進行SDSPAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含5%牛奶的封閉液封閉12 h，加入1∶1 000稀釋的抗NF-κB p65、IκB、GAPDH 一抗，4℃ 孵育過夜，TBST 緩沖液(0.05%Tween-20的TBS緩沖液)洗膜10 min×3次，以1∶5 000稀釋HRP標記的二抗，室溫孵育 1～2 h，TBST洗膜3次，每次15 min，化學發(fā)光試劑顯色，膠片顯影，掃描膠片后用凝膠圖像分析系統(tǒng)測光密度值。

2 結(jié)果

2.1 Hoechst33258染色觀察內(nèi)皮細胞形態(tài) 熒光顯微鏡下可見對照組細胞的胞核形態(tài)大小較為一致，均勻藍染，H2O2組凋亡細胞增多，凋亡的內(nèi)皮細胞染色質(zhì)濃染，核染色較明亮，可見凋亡小體;TSG組凋亡細胞數(shù)目明顯減少(Fig 1)。

2.2 MTT法檢測內(nèi)皮細胞的增殖率 MTT結(jié)果顯示，H2O2處理組內(nèi)皮細胞的增殖率較對照組下降，差異有顯著性(P＜0.01);TSG預處理組細胞增殖率較H2O2組升高(P＜0.01)，表明TSG預處理能改善H2O2對內(nèi)皮細胞的損傷，增加內(nèi)皮細胞的增殖率(Fig 2)。

2.3 流式細胞儀檢測內(nèi)皮細胞凋亡率 流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，對照組、H2O2組和TSG組的凋亡率分別為(2.0±0.2)%、(28.6±3.5)%和(14.9±3.2)%，與空白對照組相比，H2O2組細胞凋亡率升高(P＜0.01);TSG預處理HUVECs 24 h后，細胞凋亡率降低，與 H2O2組相比，差異有顯著性(P＜0.01)，表明TSG能抑制過氧化氫誘導的內(nèi)皮細胞凋亡。

Fig 1 Morphological observation of HUVECs(Hoechest dye，×200)A:Control;B:H2O2;C:TSG

Fig 2 Proliferation rates of HUVECs＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs H2O2

2.4 TSG對H2O2誘導凋亡內(nèi)皮細胞NF-κB表達的影響 與空白對照組相比，H2O2組NF-κB mRNA及蛋白表達增加(P＜0.01);經(jīng)TSG預處理后，NF-κB mRNA及蛋白表達較H2O2組降低，差異有顯著性(P ＜0.01)。見Fig 3，4。

Fig 3 NF-κB mRNA expression of HUVECs

Fig 4 NF-κB protein expression of HUVECs

2.5 TSG對H2O2誘導凋亡內(nèi)皮細胞IκB表達的影響 RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示，H2O2處理后，內(nèi)皮細胞中IκB mRNA及蛋白表達較對照組降低，差異均有統(tǒng)計學意義;經(jīng)TSG預處理后，細胞中IκB mRNA及蛋白水平均較H2O2模型組升高，P＜0.01。見 Fig 5，6

3 討論

血管內(nèi)皮細胞是血液和組織之間的屏障，具有多種重要的生物學功能，在氧化應激等因素刺激下［7］，會引起內(nèi)皮細胞損傷、凋亡，并導致內(nèi)皮功能紊亂，從而啟動和參與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，內(nèi)皮細胞過度凋亡會促進As斑塊糜爛，繼發(fā)血栓形成［8］，因此，保護血管內(nèi)皮細胞成為防治As研究的熱點之一。

研究發(fā)現(xiàn)，As斑塊和組織中存在明顯的NF-κB激活和 IκBα 的降解［9］，NF-κB/IκB 途徑是炎癥反應和凋亡信號轉(zhuǎn)導的關鍵，在形成動脈粥樣硬化的復雜網(wǎng)絡信號通路中，該通路是其中的一個重要環(huán)節(jié)。但是，NF-κB在促進細胞凋亡還是抑制細胞凋亡方面仍存在爭議。p65過表達時，NF-κB抑制細胞凋亡［10］，NF-κB的激活能抑制小鼠肝細胞凋亡并對肝細胞損傷具有保護作用［11］。但當c-Rel表達增加時，NF-κB則促進細胞凋亡的發(fā)生，Campbell等［12］發(fā)現(xiàn)可以通過NF-κB信號通路抑制抗凋亡基因的表達使細胞發(fā)生凋亡，在紫外線誘導人黑色素瘤細胞凋亡過程中發(fā)現(xiàn)NF-κB表達的下調(diào)也伴隨著細胞凋亡數(shù)的減少。Aoki等［13］研究證實在氧化應激誘導的內(nèi)皮細胞凋亡中，NF-κB被激活并誘導內(nèi)皮細胞凋亡;間歇性高糖條件下也可誘導內(nèi)皮細胞凋亡并激活NF-κB信號通路［14］。這些研究結(jié)果均表明，NF-κB在細胞凋亡中的作用是復雜的，NF-κB在細胞凋亡中是起抑制凋亡還是促進凋亡作用取決于不同的刺激因素及細胞類型，并與激活的NF-κB亞單位的種類及數(shù)量有關，對于血管內(nèi)皮細胞而言，NF-κB 能促進細胞凋亡［6，13-15］。

Fig 5 IκB mRNA expression of HUVECs

Fig 6 IκB protein expression of HUVECs

本實驗室前期研究表明TSG對H2O2誘導損傷的內(nèi)皮細胞具有保護作用，其機制可能是通過抑制NF-κB活化而降低炎性因子的表達來實現(xiàn)［16］。但TSG是否通過NF-κB信號通路調(diào)節(jié)相關凋亡基因的表達來抑制細胞凋亡尚未見文獻報道。本實驗在H2O2誘導HUVECs凋亡的模型中發(fā)現(xiàn)，300μmol·L-1的H2O2即可上調(diào) NF-κB p65 mRNA及蛋白水平，同時IκB mRNA及蛋白表達量降低，此時細胞增殖率明顯下降，細胞凋亡率升高，說明了在HUVECs凋亡的過程中H2O2可能通過促進NF-κB的抑制蛋白 IκB 的降解，使 NF-κB 信號通路激活，NF-κB p65活化入核，與核內(nèi)DNA結(jié)合，轉(zhuǎn)錄調(diào)控細胞凋亡相關基因表達，誘發(fā)細胞凋亡。與H2O2損傷組相比，10 μmol·L-1TSG 預處理組 NF-κB p65mRNA 及蛋白表達減低，IκB的mRNA及蛋白表達量升高，提示TSG可能通過抑制了NF-κB/IκB信號通路的激活，抑制氧化應激誘導的內(nèi)皮細胞凋亡，從而發(fā)揮保護內(nèi)皮的作用。

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