丁建英，倪偉偉，張根華，詹月華，權(quán)英，韓劍眾

1(常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟，215500)2(浙江工商大學(xué)食品質(zhì)量與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州，310035)

聚硫堇修飾的一次性葡萄糖生物傳感器的研制*

丁建英1，倪偉偉1，張根華1，詹月華1，權(quán)英1，韓劍眾2

1(常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟，215500)2(浙江工商大學(xué)食品質(zhì)量與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州，310035)

研制了一種用于食品中葡萄糖快速檢測(cè)的一次性電化學(xué)酶?jìng)鞲衅?。通過(guò)循環(huán)伏安法將電子媒介體硫堇電聚合在絲網(wǎng)印刷碳(SPCE)電極上，然后用殼聚糖二氧化硅溶膠凝膠包埋葡萄糖氧化酶，涂布于已修飾硫堇的絲網(wǎng)印刷碳電極表面，制成了新型葡萄糖生物傳感器。實(shí)驗(yàn)表明該傳感器響應(yīng)快、靈敏度高、穩(wěn)定性好，在對(duì)葡萄糖測(cè)定中表現(xiàn)出良好的響應(yīng)特性，并具有抗檸檬酸、抗壞血酸、苯甲酸鈉、蔗糖、果糖等干擾的特點(diǎn)。在葡萄糖濃度為5.2×10－5～2.5×10－3mol/L，酶電極的響應(yīng)電流的變化值與葡萄糖的濃度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性方程為Y=0.049 01+2.729 32x，最低檢出限為4.96×10－6mol/L。

葡萄糖，硫堇，酶?jìng)鞲衅鳎z網(wǎng)印刷碳電極

葡萄糖是食品加工、發(fā)酵工業(yè)和食品品質(zhì)控制的一個(gè)重要分析指標(biāo)。目前國(guó)內(nèi)外葡萄糖測(cè)定方法主要有:分光光度法［1－2］、旋光度法［3］、色譜法［4－6］等。這些檢測(cè)方法各有其優(yōu)點(diǎn)，但操作繁瑣，或所需儀器昂貴，無(wú)法對(duì)大批量樣品中葡萄糖進(jìn)行快速、實(shí)時(shí)檢測(cè)。

酶生物傳感器結(jié)合了酶對(duì)底物催化的特異性和電化學(xué)分析法的靈敏性［7］，近年來(lái)在醫(yī)學(xué)［8－9］、環(huán)境［10］、食品檢測(cè)［11－13］中有廣泛的研究應(yīng)用。利用葡萄糖氧化酶的酶法分析而研制的葡萄糖酶?jìng)鞲衅魇情_(kāi)展最早的一類(lèi)酶生物傳感器［14］。在酶?jìng)鞲衅鞯难兄浦须娮用浇轶w的使用提高了電化學(xué)法檢測(cè)的靈敏度，又減少了干擾［14］，其中包括二茂鐵及其衍生物［14］、普魯士藍(lán)［15］、天青Ⅰ［16］等電子傳遞體都有用于葡萄糖酶?jìng)鞲衅鞯难芯俊?/p>

硫堇是一種良好的電子傳遞體，經(jīng)電聚合后形成聚合膜穩(wěn)定性好，不易流失，且具有快速傳遞電子的能力。由于聚硫堇具有良好的穩(wěn)定性、電化學(xué)可逆性和電子傳遞性能［17－18］，因此可用于酶免疫傳感器的研制。殼聚糖與二氧化硅形成的溶膠凝膠能較好用于酶的固定并保持酶的活性［19－20］。近年來(lái)絲網(wǎng)印刷電極的生物傳感器的研究已經(jīng)有大量報(bào)道。其顯著特點(diǎn)是制備簡(jiǎn)單，能夠大批量生產(chǎn)重現(xiàn)性好的生物傳感器，而且成本低廉，操作簡(jiǎn)單，體積小，具有很好的發(fā)展前景。

本文用循環(huán)伏安法在絲網(wǎng)印刷碳電極上電聚合硫菫作為電子傳遞體，利用殼聚糖－二氧化硅溶膠-凝膠將納米金葡萄糖氧化酶固定于聚硫堇修飾絲網(wǎng)印刷碳電極表面，制備一次性葡萄糖酶生物傳感器。將該傳感器用于市售飲料中葡萄糖的快速檢測(cè)顯示出較好的準(zhǔn)確性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CHI660C電化學(xué)工作站 ，上海辰華儀器公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司;78-1型磁力加熱攪拌器，上海南匯電訊器材廠(chǎng);電熱恒溫干燥箱，上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;FA2004電子分析天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司;pH計(jì)，上海精科實(shí)業(yè)有限公司;超聲波清洗器，上海聲析超聲儀器有限公司;旋渦混合器 ，上海精科實(shí)業(yè)有限公司;絲網(wǎng)印刷碳電極，浙江工商大學(xué)食品質(zhì)量與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。葡萄糖氧化酶 (G4029，10 000 U)，Sigma公司;硫堇、D-葡萄糖、正硅酸乙酯、氯金酸、檸檬酸鈉、抗壞血酸 (分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);殼聚糖 (脫乙酰度95%)，浙江金殼生物有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 絲網(wǎng)印刷電極的預(yù)處理

按文獻(xiàn)［21］方法處理電極，將絲網(wǎng)印刷碳電極用二次蒸餾水沖洗干凈。試驗(yàn)前可將絲網(wǎng)印刷碳電極置于0.1 mol/L、pH 6.0的磷酸緩沖溶液(PBS)中以0.05 V/s的速率循環(huán)伏安法(cyclic voltammetry，CV)掃描若干圈，直至循環(huán)曲線(xiàn)穩(wěn)定后停止掃描，并取出電極用清水沖洗，備用。

1.2.2 硫堇聚合修飾電極

［21］硫堇電聚合的方法，將預(yù)處理好的絲網(wǎng)印刷碳電極置于5 mmol/L硫堇醋酸緩沖溶液(pH 4.5)中，在－0.35～0.1 V電壓范圍內(nèi)以0.05 V/s的速率CV法掃描50圈后形成聚硫堇膜。聚合后的電極用二次蒸餾水沖洗后置于pH 6.0的PBS緩沖溶液上方保存。

1.2.3 酶電極的制備

用移液槍吸取100 μL殼聚糖醋酸溶液(1 g殼聚糖溶于100 mL 1%的乙酸溶液)、10 μL正硅酸乙酯和20 μL無(wú)水乙醇置于旋渦混合器上進(jìn)行混合，靜置0.5 h制成殼聚糖-二氧化硅溶膠凝膠。按文獻(xiàn)［22］中檸檬酸三鈉還原法制備納米金，再將納米金(取前需超聲)與葡萄糖氧化酶溶液(25 g/L)按照1∶1混合。從混好的殼聚糖有機(jī)無(wú)機(jī)溶膠凝膠取出10 μL與10 μL結(jié)合納米金的酶混合均勻，用微量注射器吸取10 μL上述混合物間隔4 h分2次滴加于聚硫堇修飾電極上，在4℃的冰箱中放置10～12 h，將制得的酶電極置于pH 6.0的PBS緩沖液上方，4℃冰箱保存。

1.2.4 測(cè)定方法

采用三電極系統(tǒng):葡萄糖氧化酶修飾電極為工作電極，Pt電極為輔助電極，飽和甘汞電極為參比電極。用循環(huán)伏安法對(duì)酶電極進(jìn)行表征，并結(jié)合計(jì)時(shí)電流法對(duì)酶電極的檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化以及對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)。檢測(cè)體系采用10 mL 0.1 mol/L的 PBS(pH6.0)溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶電極的電化學(xué)表征

2.1.1 酶?jìng)鞲衅鞯难h(huán)伏安特性

在掃速為50mV/s，掃描范圍為－0.4～0.1 V電位內(nèi)，采用循環(huán)伏安法研究不同修飾階段電極的電化學(xué)特性。圖1顯示了制備過(guò)程中不同電極在0.1 mol/L，pH 6的PBS溶液中的CV圖。圖1(a)為未修飾的絲網(wǎng)印刷碳電極CV掃描情況?？梢?jiàn)絲網(wǎng)印刷碳電極在磷酸緩沖溶液中無(wú)氧化還原峰;圖1(b)為絲網(wǎng)印刷電極聚合了硫堇，在磷酸緩沖溶液中的循環(huán)伏安法的掃描情況?？梢?jiàn)聚硫堇電極在磷酸緩沖溶液中有明顯氧化還原峰出現(xiàn)，說(shuō)明了硫堇成功聚合在電極表面，形成了良好的導(dǎo)電膜;圖1(c)為在聚硫堇絲網(wǎng)印刷電極上修飾了殼聚糖二氧化硅溶膠凝膠納米金酶復(fù)合物后，循環(huán)伏安掃描情況。圖中氧化還原峰有所下降，這是由于聚硫堇絲網(wǎng)印刷電極修飾了溶膠凝膠納米金酶復(fù)合物后，部分阻斷了電子在電極和溶液之間的傳遞，使峰電流減小。圖1(d)為在磷酸緩沖溶液中加入0.1 mmol/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液后，修飾好的電極進(jìn)行循環(huán)伏安掃描情況。其氧化峰電流迅速增大，還原峰電流減小，顯示出明顯的電催化特征，說(shuō)明固定在修飾膜上的葡萄糖氧化酶(GOD)對(duì)葡萄糖有明顯的電催化還原作用。

圖1 不同修飾電極在PBS緩沖液中的循環(huán)伏安圖

以聚硫堇為電子媒介體的葡萄糖生物傳感器的反應(yīng)原理［18］如下:

2.1.2 掃速對(duì)酶電極的影響

以0.1 mol/L，pH值為6的磷酸緩沖溶液為底液，酶修飾電極為工作電極，以不同的掃速(20～300 mV/s)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描。如圖2所示，峰電流隨著掃速的增大而增大，峰電位基本不變。

如圖2所示，峰電流與掃速平方根的之間有良好的線(xiàn)性關(guān)系，說(shuō)明電極受表面擴(kuò)散控制的電化學(xué)反應(yīng)過(guò)程。

2.2 酶?jìng)鞲衅鞯男阅?/p>

2.2.1 pH值的影響

溶液的pH值對(duì)酶的活性影響很大，酶在一定的pH值范圍內(nèi)才表現(xiàn)出較好的催化活性。在某一pH值時(shí)，酶的催化活性最高，此時(shí)的pH值為最適pH值，一般最適pH值在中性(pH 7)左右波動(dòng)?？疾烀鸽姌O在pH值為3.0到8.0范圍的磷酸緩沖液中對(duì)0.1 mmol/L葡萄糖的響應(yīng)(圖3)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，酶電極在pH 5～6時(shí)響應(yīng)電流最大，且隨著pH的增大，峰電位逐漸負(fù)移?？紤]到聚硫菫的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)中以pH 6.0的磷酸緩沖溶液為測(cè)試底液。

圖2 掃速對(duì)酶電極的影響注:由內(nèi)到外，掃速分別為 20，30，50，80，100，150，200，250，300(mV/s)，底液為10 mL0.1 mol/L 的 pH 6.0 的 PBS。

圖3 pH值對(duì)酶電極響應(yīng)的影響(底液為10－4mol/L葡萄糖PBS液，掃速50 mV/s)

2.2.2 溫度的影響

溫度是影響酶催化反應(yīng)的重要因素。酶的活性也與溫度有直接關(guān)系，溫度升高，酶的催化反應(yīng)速度加快，但高溫會(huì)使酶發(fā)生變性而失活。酶的活性一般在37℃左右最強(qiáng)。在pH6的磷酸緩沖溶液中，15～45℃測(cè)定了酶電極對(duì)10－4mol/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)(圖4)。實(shí)驗(yàn)表明，隨著溫度升高，響應(yīng)電流不斷增大，當(dāng)達(dá)到35℃時(shí)，電極響應(yīng)電流值達(dá)到最大，說(shuō)明此時(shí)酶的催化速率最高，進(jìn)一步升高溫度時(shí)催化電流值下降，說(shuō)明酶的活性開(kāi)始下降。考慮到電極靈敏度和使用壽命，測(cè)定時(shí)底液溫度選擇為25℃。

圖4 溫度對(duì)酶電極響應(yīng)的影響(底液為含10－4mol/L葡萄糖的pH 6.0 PBS液)

2.2.3 干擾試驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)［19－20］測(cè)定電極的抗干擾能力，在1.5×10－3mol/L葡萄糖濃度下，分別加入同樣濃度的抗壞血酸(ascorbic acid)、檸檬酸(citric acid)，10倍濃度的苯甲酸鈉(sodium benzoate)、蔗糖(sucrose)、果糖(fructose)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)電極響應(yīng)電流值無(wú)明顯變化(見(jiàn)圖5)，即添加物對(duì)電極響應(yīng)均無(wú)干擾。說(shuō)明了該傳感器具有較好的選擇性和抗干擾能力。這是因?yàn)檩^低的工作電位(－0.4V)可有效減少其他物質(zhì)的干擾。

圖5 幾種干擾物質(zhì)對(duì)葡萄糖測(cè)定的影響

2.3 酶?jìng)鞲衅鲗?duì)葡萄糖的響應(yīng)及實(shí)際樣品的測(cè)定

2.3.1 酶電極對(duì)葡萄糖響應(yīng)的校正曲線(xiàn)

在選定最佳實(shí)驗(yàn)條件下，取10 mL PBS(pH6.0)緩沖液，往溶液中連續(xù)加入0.4～300μL不等的0.1 mol/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，記錄加入標(biāo)準(zhǔn)溶液后的電流－時(shí)間的響應(yīng)曲線(xiàn)(見(jiàn)圖6(a))。再對(duì)葡萄糖濃度和相應(yīng)的響應(yīng)電流變化值作校正曲線(xiàn)(見(jiàn)圖6(b))。

從圖6可以看出，酶電極對(duì)葡萄糖有很好的電流響應(yīng)性，酶電極在 20 s達(dá)到穩(wěn)態(tài)電流，比文獻(xiàn)［23－24］報(bào)道的酶電極響應(yīng)快，在葡萄糖溶液為5.2×10－5～2.5×10－3mol/L濃度范圍內(nèi)，響應(yīng)電流的變化值(ΔI)與葡萄糖的濃度(C)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性方程為 ΔI(μA) =0.049 01+2.729 32 C(mmol/L)，相關(guān)系數(shù)為0.999 26，最低檢出限為4.96×10－6mol/L。

2.3.2 酶?jìng)鞲衅鲗?duì)實(shí)際樣品中葡萄糖的測(cè)定及回收試驗(yàn)

將酶?jìng)鞲衅饔糜趯?shí)際樣品的檢測(cè)及回收率試驗(yàn)，取2瓶常見(jiàn)品牌的飲料作為待測(cè)的實(shí)際樣品，搖勻后取樣，取不同量的樣品加入PBS液中，每種飲料設(shè)3個(gè)濃度，按上述方法用酶電極用上述方法進(jìn)行測(cè)定，記錄電流時(shí)間曲線(xiàn)，通過(guò)校正曲線(xiàn)計(jì)算葡萄糖濃度，并在以上6份實(shí)際樣品中分別加入一定濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，用同樣方法進(jìn)行回收率試驗(yàn)。

圖6 (a)酶電極對(duì)葡萄糖的電流-時(shí)間響應(yīng)曲線(xiàn);(b)酶電極對(duì)葡萄糖響應(yīng)的校正曲線(xiàn)(底液:0.1MPBS(pH6.0)，工作電壓:－0.4V，室溫:25±1℃)

表1 實(shí)際樣品的測(cè)定及回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

如表1所示，本法的回收率為 94.2% ～103.5%，說(shuō)明本法制得的葡萄糖酶?jìng)鞲衅鲗?duì)葡萄糖含量的測(cè)定具有良好的準(zhǔn)確度。

2.3.3 酶電極的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

本葡萄糖傳感器在0.1 mol/L PBS(pH6.0)中用循環(huán)伏安法連續(xù)循環(huán)掃描50圈，電流值幾乎不變。在相同適宜條件下，用計(jì)時(shí)電流法連續(xù)2天用同一電極對(duì)0.1 mmol/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液中重復(fù)測(cè)試20次，其響應(yīng)電流變化值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.7%。分別取不同批次制備的酶電極對(duì)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測(cè)，其結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.8%(n=5)，說(shuō)明該電極具有良好的重現(xiàn)性。酶電極不用時(shí)，在4℃的磷酸緩沖溶液上方保存，7天后，該電極的活性下降約4.67%，14天后，該電極的活性為90.12%，酶電極的穩(wěn)定性與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)介體型葡萄糖傳感器［15］相近，顯示出較好的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

將硫堇聚合于絲網(wǎng)印刷電極表面，用殼聚糖-二氧化硅溶膠-凝膠將結(jié)合有納米金的葡萄糖氧化酶固定于聚硫堇電極表面制備葡萄糖生物傳感器。該傳感器對(duì)葡萄糖響應(yīng)快、靈敏度高，并具有較好的穩(wěn)定性和抗干擾性。用于食品樣品中葡萄糖的快速檢測(cè)顯示出較高的準(zhǔn)確性，絲網(wǎng)印刷電極與文獻(xiàn)中制備葡萄糖傳感器常用的金屬電極相比具有制備簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，不需前處理等優(yōu)點(diǎn)，如能實(shí)施批量生產(chǎn)絲網(wǎng)印刷酶電極，其一致性好，成本低廉，因此該傳感器將在食品加工、發(fā)酵工業(yè)和食品品質(zhì)控制方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Fabrication of Glucose Biosensor Based on Poly(thionine)Modified on the Screen-printed Electrode

Ding Jian-ying1，Ni Wei-wei1，Zhang Gen-hua1，Zhan Yue-hua1，Quan Ying1，Han Jian-zhong2
1(College of Biotechnology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，China)2(Zhejiang Gongshang University，F(xiàn)ood Safety Key Lab of Zhejiang Province，Hangzhou 310035，China)

A novel electrochemical enzyme biosensor for determintion of glucose in food was developed by poly(Thionine)and glucose oxidase on the Screen-printed electrode by chitosan organic and inorganic sol-gel.The biosensor shows fast response，high sensitivity and good stability.In addition，the biosensor operated at low potential would be interference free from ascorbic acid，citric acid，sodium benzoate，sucrose，fructose.Under optimal experimental conditions，The linear response of the sensor to glucose was in the concentration range of 5.2 ×10－5－2.5 ×10－3mol/L with a detection limit of 4.96 ×10－6mol/L.

glucose，thionine，enzyme biosensors，screen － printed electrode

碩士，講師(張根華教授為通迅作者)。

*蘇州市農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目(SNG0836);蘇州市社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目(SZD0927)

2011－06－16，改回日期:2011－09－06