方佳琪，竺德強，柯芳芳，陳曉琳，張明

(安徽農業(yè)大學生命科學學院，安徽合肥，230036)

pH吸附法純化乳酸乳球菌素Lacticin LLC518*

方佳琪，竺德強，柯芳芳，陳曉琳，張明

(安徽農業(yè)大學生命科學學院，安徽合肥，230036)

對乳酸乳球菌素Lacticin LLC518在不同pH條件下產生菌的吸附作用進行研究，結果表明，pH 6.0時吸附率達100%，pH 2.0時吸附率為0。利用該特性，可將產生菌細胞從發(fā)酵液中分離，制備Lacticin LLC518粗制品。通過與硫酸銨沉淀樣品進行對照，表明pH吸附法具有良好的分離效果，Lacticin LLC518的回收率為20%，純化倍數(shù)高達83.02。

乳酸乳球菌素，pH吸附，分離，層析技術，效率

細菌素是一些細菌產生的具有抑菌生物活性的蛋白質類物質，一般抑制與產生菌同種的其它菌株或親緣關系相近的菌株［1］，但有些可以抑制親緣關系較遠的菌株甚至霉菌［2］。細菌素由于可被人類腸胃道分泌的蛋白酶降解，對人體無毒副作用，因而在食品工業(yè)中可作為食品的保鮮劑，乳酸鏈球菌素Nisin就是目前廣泛應用于食品保鮮的細菌素［3］。

在食品工業(yè)中，廣泛使用膜過濾和噴霧干燥技術制備食品保鮮用途的細菌素［4］，而在理論研究中多采用硫酸銨沉淀和各種層析技術相結合的多步法純化樣品［5－6］。1992 年 Yang等［7］研究了 Nisin 等 4 種細菌素的吸附性能，發(fā)現(xiàn)這些細菌素對產生菌的最適吸附和解吸附pH值分別在6.0和2.0附近。研究表明，細菌素產生菌一般都能吸附其產生的細菌素分子［8］，吸附和解吸附的特性基于細菌素的帶電特性，且易受到各種鹽類及有機試劑的影響［9－11］，但是在吸附的過程中是否具有選擇性，尚未見報道。本文以乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp.lactis)LLC518對所產細菌素Lacticin LLC518的吸附和解吸附作用為基礎，以硫酸銨沉淀樣品為對照，利用各種層析技術對比分析pH吸附法的有效性，為該細菌素的進一步純化和在食品工業(yè)中的應用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

指示菌乳桿菌(Lactobacillus sp.)LPX801和乳酸菌素Lacticin LLC518產生菌乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp.lactis)LLC518均為本實驗室篩選所得。

1.1.2 培養(yǎng)基

指示菌及細菌素產生菌的培養(yǎng)基均為MRS培養(yǎng)基［12］。

1.1.3 主要試劑與儀器

Sephadex G－50(GE)，三氟乙酸(Sigmaaldrich)，乙腈(山東禹王實業(yè)有限公司化工分公司)，硫酸銨(生工生物工程上海有限公司)，其它試劑均為分析純。

Aglient－1100反相高效液相色譜，Aglient;TH－500梯度混合器、HL－2橫流泵、電腦核酸蛋白檢測儀、電腦全自動部分收集器，上海青浦滬西儀器廠;FD－1真空冷凍干燥機，北京東南儀誠設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸乳球菌素Lacticin LLC518活性及效價的測定

采用打孔法［13］測定Lacticin LLC518的活性，將OD600為1.5的乳桿菌LPX801菌懸液280 μL加入到已熔化并冷卻至50℃的30 mL MRS固體培養(yǎng)基中，混勻倒平板，待凝固后以直徑7 mm的打孔器均勻打孔，以熔化的10 μL素瓊脂封底并向孔內等量加入待測樣品，4℃擴散5 h后，37℃培養(yǎng)12 h，觀察是否出現(xiàn)抑菌圈。采用二倍稀釋法［14］測定Lacticin LLC518的效價，以觀察到抑菌圈出現(xiàn)的最高稀釋度定義為1個活力單位(1 AU)，其倒數(shù)即為細菌素的效價(AU/mL)。

1.2.2 蛋白質濃度的測定

Lowry 法［15］。

1.2.3 硫酸銨沉淀法分離制備乳酸乳球菌素Lacticin LLC518粗提液(CPA)

接種乳酸乳球菌LLC518到MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜止培養(yǎng)12 h作為種子液(OD600=1.5)，按4%的接種量接入250 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜止培養(yǎng)24 h。4℃、8 000 r/min離心20 min。將上清液以 40% 飽和度硫酸銨進行沉淀［16］，12 h 后，4℃，10 000 r/min離心45 min。將沉淀溶解于水，以截留分子質量為2 000 u的透析袋對水透析12 h，收集透析液，測定其效價并冷凍干燥制成干粉。

1.2.4 空載細胞的制備［6］

按4%的接種量將乳酸乳球菌LLC518接種于500 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜止培養(yǎng)24 h，4℃、8 000 r/min離心20 min，收集菌體。以5 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 6.0)洗滌細胞3次，離心后將細胞懸于1.0 mol/L NaCl溶液中。用體積比為5%的磷酸調pH值至2.0，放置30 min后重懸于無菌水中，100℃，加熱15 min，使殘留在菌體表面的細菌素失活，4℃振蕩1 h，以確保細胞表面已沒有吸附的細菌素。8 000 r/min離心20 min收集菌體細胞并重懸于100 mL無菌水中備用，檢測其抑菌活性。

1.2.5 空載細胞對細菌素吸附能力的測定［7］

稱取一定量的Lacticin LLC518干粉溶于2 mL水中，將0.1 mL的Lacticin LLC518溶液加入1.8 mL不同pH值的5 mmol/L磷酸鈉溶液中，分別加入0.1 mL細胞懸液。以0.1 mL蒸餾水代替Lacticin LLC518為對照X，以0.1 mL蒸餾水代替細胞懸液為對照Y。將上述混合物在4℃作用1 h后，15 000 r/min，離心5 min，分別取上清液測定其效價，并計算吸附率。

1.2.6 pH吸附法分離制備乳酸乳球菌素Lacticin LLC518粗提液(CPP)

按4%的接種量將乳酸乳球菌種子液接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)13 h。發(fā)酵液置于70℃水浴25 min，調至最適吸附 pH 6.0，4℃放置2 h，9 000 r/min離心25 min，收集菌體細胞懸于0.1 mol/L，pH 2.0 的 NaCl溶液中，4℃，2 h 后，9000 r/min離心25 min，上清液經0.22 μm濾膜過濾，取濾液。將解吸附后的細胞與吸附后的上清液均勻混合，重復上述吸附和解吸附過程。合并濾液即為乳酸菌素Lacticin LLC518的粗提液。

1.2.7 pH吸附法與硫酸銨沉淀法分離效果的檢測

40%硫酸銨沉淀得到的蛋白粗提液(CPA)及pH吸附后的蛋白粗提液(CPP)經透析處理，0.22 μm濾膜過濾后進行凝膠層析和RP-HPLC分析。具體條件如下:

分子篩凝膠層析柱填料為Sephadex G－50，柱型號為26×100 cm，上樣量為5 mL，流速為1.5 mL/min。流動相為二級水。分別收集各峰洗脫液，凍干后進行抑菌活性的測定。

RP－HPLC層析采用C18半制備柱Waters Symmetry ShieldTM(5 μm ，19 mm ×150 mm)，上樣量 970 μL，流速為 2.5 mL/min，柱溫 25℃，檢測波長 215 nm，洗脫液A相為超純水，B相為色譜純乙腈。洗脫程序:0～6 min:0～5%B，6～66 min:5% ～100%B，66～80 min:100%B;收集各峰洗脫液，凍干后進行抑菌活性的測定。

2 結果與討論

2.1 pH吸附體系的建立

為了建立本實驗所用菌株及細菌素的pH吸附體系，以40%飽和度硫酸銨沉淀制備的粗細菌素產品為吸附材料，檢測空載細胞在不同pH條件下對Lacticin LLC518的吸附率(圖1)。

圖1 不同pH對Lacticin LLC518吸附率的影響

從圖1可知，Lacticin LLC518在pH 2.0時，吸附率為0，隨后吸附率逐漸上升，在 pH 6.0時達到100%，即細菌素完全吸附于產生菌上，pH 7.0后吸附率逐漸下降，在 pH 10.0時，吸附率下降到27.32%，從而確定pH 6.0為吸附pH值，pH 2.0為解吸附pH值，這一結果與康牧旭等［17］研究的乳酸片球菌素PA003對產生菌的吸附條件近似。

2.2 硫酸銨沉淀樣品及pH吸附樣品的分析

2.2.1 凝膠層析(Sephadex G-50)

將硫酸銨沉淀樣品(CPA)及pH吸附樣品(CPP)分別進行凝膠層析分析(圖2、圖3)，收集各峰并測定活性。

圖2 硫酸銨沉淀樣品的Sephadex G－50凝膠層析圖譜

圖3 pH吸附樣品的Sephadex G－50凝膠層析圖譜

經凝膠層析后，硫酸銨沉淀樣品有2個峰(圖2)，經抑菌實驗證實第1個峰為活性峰，第2個峰為雜蛋白峰。而在同一條件下，pH吸附樣品只有1個峰且抑菌活性高于硫酸銨沉淀樣品的活性，可見通過pH吸附可去除部分雜蛋白。

2.2.2 RP-HPLC

將硫酸銨沉淀樣品(CPA)及pH吸附樣品(CPP)分別進行Sephadex G-50凝膠層析后，活性峰再經RP-HPLC層析分析，結果如圖4及圖5。

由圖譜可知，pH吸附后的樣品出峰數(shù)少于硫酸銨沉淀樣品，且達到了基線分離，組份間分辨率較高。結果表明在pH吸附法中，菌體細胞可以較為專一地吸附發(fā)酵液中的細菌素分子，而對其他的雜蛋白吸附率不高，因而該方法可選擇性的吸附細菌素，從而提高樣品純度。

圖4 硫酸銨沉淀樣品的RP－HPLC圖譜

圖5 pH吸附樣品的RP－HPLC圖譜

2.3 不同分離方法的比活及回收率的比較

以空載細胞作為吸附細胞時，Lacticin LLC518在pH 6.0時的吸附率達到了100%。為了明確pH吸附法從發(fā)酵液中分離Lacticin LLC518的效果，以pH 6.0吸附、pH 2.0解吸附為試驗條件從發(fā)酵液中分離制備Lacticin LLC518粗制品，其比活由發(fā)酵原液的10.67 AU/mg提高到885.81 AU/mg，純化倍數(shù)提高83.02倍。硫酸銨沉淀法制備的粗制品比活提高到334.64 AU/mg，純化倍數(shù)提高31.36倍(表1，表2)。

表1 硫酸銨沉淀純化Lacticin LLC518的純化表

表2 pH吸附法純化Lacticin LLC518的純化表

由表1及表2可知，經pH吸附法分離純化后， 樣品純化倍數(shù)高于經硫酸銨沉淀法制備的樣品。2種粗制品經G－50凝膠層析后，純化倍數(shù)分別為139.09和38.57，且前者比活為1484.06，比之 CPA提高了3.6倍，說明pH吸附法分離效果較硫酸銨沉淀法好。但回收率僅為20%，低于硫酸銨沉淀法的36.09%。為了提高回收率，采用多次吸附的方法對發(fā)酵液中的細菌素進行了吸附研究(圖6)。

圖6 多次吸附對Lacticin LLC518吸附效率的影響■－上清液中蛋白質濃度;●－解吸液蛋白質濃度國;▲－上清液抑菌圈直徑;▼－回收率

由圖6可知，多次吸附后上清液蛋白質濃度呈下降趨勢，減少的蛋白質量與解吸液中的蛋白質濃度基本保持一致，說明蛋白質被細胞吸附后能夠有效的釋放到解吸液中，因而利用空載細胞建立的吸附解吸附系統(tǒng)可以有效的應用于發(fā)酵液中細菌素的分離。

在第1次和第2次吸附后，上清液的蛋白質濃度下降較大，分別從49.25 mg/mL下降到43.14 mg/mL和從43.14 mg/mL下降到36.30 mg/mL。但上清液的抑菌作用在第1次吸附前后變化較小，說明較多抑菌物質未被吸附，仍殘留在上清液中，而經2次吸附后，上清液的抑菌作用顯著降低，說明大部分的細菌素被吸附。造成這一現(xiàn)象的主要原因可能在于第1次吸附時細胞的吸附位點上可能已經有部分細菌素占據(jù)，或由于發(fā)酵液中存在著大量的細菌素而吸附位點數(shù)量有限而趨于飽和。在第1次解吸附處理后，大量吸附位點得到釋放，進而在第2次吸附時可以進一步吸附大量的細菌素，最終使第2次吸附后，殘留在上清液中的細菌素大量減少，因而抑菌活性顯著減低。

但隨著吸附次數(shù)的增加，特別經第5次吸附后，上清液中殘留的蛋白質含量維持穩(wěn)定，抑菌作用變化較小，說明后續(xù)增加吸附次數(shù)并不能增加細菌素的吸附以及雜蛋白的吸附，因而利用pH吸附法吸附細菌素專一性較強。同時，每次吸附的回收率隨著吸附次數(shù)的增加而降低，由第1次的20%下降到第5次的0.63%，但總回收率達到53.13%，高于硫酸銨沉淀法的36.09%。

3 結論

乳酸乳球菌LLC518產生的乳酸乳球菌素Lacticin LLC518具有安全、抑菌活性強、抑菌譜廣的特性，有作為天然食品防腐劑的潛力。為了進一步開發(fā)利用該細菌素，本文以Yang等［7］建立的pH吸附法為參照，研究了Lacticin LLC518的吸附規(guī)律，結果表明Lacticin LLC518對其產生菌細胞的吸附具有pH依賴性，在pH 6.0時完全被吸附到細胞上，在pH 2.0時完全解吸附。借助此pH吸附模型利用發(fā)酵液中的細菌素產生菌對所產Lacticin LLC518進行了分離純化。以硫酸銨沉淀樣品為對照，發(fā)現(xiàn)pH吸附法的分離效果優(yōu)于常用的硫酸銨沉淀法，其純化倍數(shù)為83.02高于硫酸銨沉淀法的31.36，并通過多次吸附處理提高了回收率，總回收率高達53.13%，凝膠層析和RP-HPLC的分析亦表明pH吸附法樣品較硫酸銨沉淀樣品雜峰少，說明pH吸附法具有良好的分離效果。本研究的結果為建立Lacticin LLC518的最佳純化方法，進而對該細菌素性質的研究以及擴大化生產奠定了基礎。

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The Studies on Purification of Lacticin LLC518 by pH-Adsorption Method

Fang Jia-qi，Zhu De-qiang，Ke Fang-fang，Chen Xiao-lin，Zhang Ming
(College of Life Sciences，Anhui Agriculture University，Hefei 230036，China)

The adsorption rates of Lacticin LLC518 on Lactococcus lactis subsp.lactis 518 at different pH conditions were studied.The results showed that the adsorption rate was 100%at pH 6.0 while no Lacticin LLC518 was adsorbed at pH 2.0.Therefore，the crude Lacticin LLC518 was prepared from the cell-free supernatant of the L.lactis subsp.lactis 518 culture when the exterior environment had a pH of 6.0 and 2.0 by absorbing and desorbing Lacticin LLC518，respectively.The pH absorption method has an obvious advantage superior to the ammonium sulphate precipitation method for its better absorption effect when the crude Lacticin LLC518 from precipitation with ammonium sulfate as a control.The specific activity of Lacticin LLC518 was increased 83.02 fold with a yield of 20% .

Lacticin，pH －adsorption，isolation，chromatography technology，efficiency

碩士研究生(張明為通訊作者)。

*國家863計劃項目(2008AA10Z319);安徽省高等學校省級質量工程項目(20101899)

2011－05－08，改回日期:2011－08－26