姚俊，孫榮斌，魏欽俊，曹新，魯雅潔

1(南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，生物技術(shù)系，江蘇南京，210029) 2(南京醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京，210029)

黏度法測(cè)定γ-聚谷氨酸含量*

姚俊1，孫榮斌2，魏欽俊1，曹新1，魯雅潔1

1(南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，生物技術(shù)系，江蘇南京，210029) 2(南京醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京，210029)

采用烏氏黏度計(jì)測(cè)定了不同濃度下γ-聚谷氨酸稀溶液的黏度，由哈金斯(Huggins)方程和克拉默(Kraemer)方程結(jié)合外推法求得室溫下γ-聚谷氨酸在中性水溶液中的特性黏度［η］為7.830 L/g，并推導(dǎo)出由溶液的相對(duì)黏度ηr與增比黏度ηsp計(jì)算γ-聚谷氨酸溶液濃度的公式。依據(jù)溶液黏度與濃度的關(guān)系，可以簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確地估算出γ-聚谷氨酸的濃度。

γ-聚谷氨酸，黏度，濃度

γ-聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid，簡(jiǎn)稱(chēng) γ-PGA)是一種由微生物發(fā)酵合成的生物高分子，由于γ-PGA水溶性好、吸水性強(qiáng)、可生物降解并具有良好的生物相容性，是不可降解的合成高分子材料(如塑料和水凝膠等)強(qiáng)有力的替代品，在工農(nóng)業(yè)、食品與醫(yī)藥等領(lǐng)域極具應(yīng)用潛力［1－3］。在γ-PGA的合成與應(yīng)用研究中，如何進(jìn)行γ-PGA的定量是一項(xiàng)十分重要的基礎(chǔ)工作，目前，文獻(xiàn)中報(bào)道的γ-PGA含量測(cè)定方法多采用凝膠滲透色譜法(GPC)［1－2］，但儀器成本昂貴，測(cè)定過(guò)程繁瑣，因而在實(shí)際應(yīng)用中受到局限。本研究采用烏氏黏度計(jì)測(cè)定了γ-PGA稀溶液的黏度，同時(shí)關(guān)聯(lián)了γ-PGA稀溶液黏度與濃度的關(guān)系，可作為簡(jiǎn)便、有效的替代方法進(jìn)行γ-PGA含量的測(cè)定，可為γ-聚谷氨酸的生產(chǎn)實(shí)踐和應(yīng)用研究帶來(lái)極大便利。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

凝膠滲透色譜儀(Alltech)，Shodex OHpak SB-806M HQ色譜柱，Thermo LINEAR UV 201紫外檢測(cè)器，SFD RI2000示差折光檢測(cè)器，烏氏黏度計(jì)(毛細(xì)管直徑0.4～0.5 mm，上海精密儀器儀表有限公司);秒表(分度0.1 s)。

1.2 γ-PGA的制備

1.2.1 菌株

γ-PGA合成菌 Bacillus subtilis PGS-1，本實(shí)驗(yàn)室自主篩選。

1.2.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 20，酵母膏 5，K2HPO4·3H2O 2，MgSO40.25，谷氨酸鈉 10，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 40，谷氨酸鈉 40，其余同種子培養(yǎng)基。

培養(yǎng)方法:32.5℃，220 r/min，種子培養(yǎng)基培養(yǎng)15 h后按1%接種量接于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h。

1.2.3 γ-PGA的分離純化

Bacillus subtilis PGS-1分批發(fā)酵獲得含γ-PGA的發(fā)酵液，經(jīng)預(yù)處理和分離純化后得γ-PGA純品，具體方法參見(jiàn)文獻(xiàn)［4］。經(jīng)GPC檢測(cè)純度達(dá)95%，分子質(zhì)量500 ku，可做為標(biāo)準(zhǔn)品用以配置不同濃度的γ-PGA稀溶液。

1.3 分析方法

1.3.1 GPC法測(cè)定γ-PGA含量與分子質(zhì)量

參見(jiàn)文獻(xiàn)［5－6］。

1.3.2 γ-PGA稀溶液黏度的測(cè)定

稱(chēng)取一定量的純品γ-PGA配置成一定濃度梯度的水溶液(pH值7.0)，室溫下采用烏氏黏度計(jì)測(cè)定γ-PGA溶液和純?nèi)軇?水)的流出時(shí)間，分別計(jì)算γ-PGA溶液的相對(duì)黏度 ηr、增比黏度 ηsp和特征黏度［η］。

1.3.3 γ-PGA發(fā)酵液相對(duì)黏度的測(cè)定

按1.2.2培養(yǎng)方法獲得的含γ-PGA發(fā)酵液pH為中性，呈黏稠糖漿狀，稀釋一定倍數(shù)后，過(guò)0.65 μm濾膜除菌，同時(shí)取濾液按1.3.1和1.3.2方法進(jìn)行GPC測(cè)定和相對(duì)黏度ηr的測(cè)定。

1.3.4 γ-PGA稀溶液黏度與濃度關(guān)系的推導(dǎo)與計(jì)算

稱(chēng)取一定量的純品γ-PGA配置成一定濃度梯度的水溶液，室溫下采用烏氏黏度計(jì)測(cè)定γ-PGA溶液和純?nèi)軇?水)的流出時(shí)間，分別計(jì)算γ-PGA溶液的相對(duì)黏度(ηr)、增比黏度(ηsp)和特征黏度(［η］)。

ηr:相對(duì)黏度，ηr= η/η0，溶液黏度對(duì)溶劑黏度的相對(duì)值。其中η0為純?nèi)軇ざ?，反映了溶劑分子間的內(nèi)摩擦;η為溶液黏度，反映了溶劑分子與溶劑分子之間、高分子與高分子之間和高分子與溶劑分子之間三者內(nèi)摩擦的綜合表現(xiàn)。當(dāng)溶質(zhì)濃度c＜10 g/L時(shí)，ηr=t/ts，其中t、ts分別為用烏氏黏度計(jì)測(cè)定的聚合物溶液和純?nèi)軇?水)的流出時(shí)間，單位是秒(s)。

ηsp:增比黏度，ηsp=(η －η0)/η0=(η/η0) －1=ηr－1=(t－ts)/ts，反映了高分子與高分子之間，純?nèi)軇┡c高分子之間的內(nèi)摩擦效應(yīng)。

在一定溫度下，聚合物溶液的黏度與濃度有一定的依賴(lài)關(guān)系。描述溶液黏度與濃度關(guān)系的方程式很多，應(yīng)用較多的有:哈金斯(Huggins)方程和克拉默(Kraemer)方程［7－8］:

其中［η］為特性黏度，反映了高分子與溶劑分子之間的內(nèi)摩擦效應(yīng)，其值與濃度無(wú)關(guān)。k為哈金斯常數(shù)，β為克拉默常數(shù)。k和β表示了溶液中高分子間和高分子與溶劑分子間的相互作用，對(duì)分子質(zhì)量不敏感。采用“外推法”可得到共同的截距［η］、以及斜率k和－β值。

由哈金斯方程和哈金斯方程推導(dǎo)可得公式(3)。將“外推法”計(jì)算得到的［η］、斜率k和－β值帶入公式(3)，可得計(jì)算溶液濃度C的公式(3)。

2 結(jié)果與討論

2.1 相對(duì)黏度(ηr)、增比黏度(ηsp)和特征黏度(［η］)的測(cè)定

稱(chēng)取定量γ-PGA純品配置成10 g/L溶液，分別稀釋為不同濃度的γ-PGA溶液，室溫下采用烏氏黏度計(jì)測(cè)定各稀釋液的流出時(shí)間t。分別計(jì)算各溶液的相對(duì)黏度(ηr)、增比黏度(ηsp)，如表1所示。

表1 不同濃度γ－PGA溶液的黏度測(cè)定結(jié)果

根據(jù)表1數(shù)據(jù)，按1.3.4所述方法，對(duì)ηsp/c－c與lnηr/c－c進(jìn)行作圖和線性擬合，如圖1所示。采用烏氏黏度計(jì)測(cè)定并計(jì)算γ-PGA的特性黏度［η］時(shí)，需要配制濃度適宜的供試溶液。供試溶液濃度過(guò)高，則流出時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，影響樣品測(cè)定的效率;濃度過(guò)低，則流出時(shí)間過(guò)短，不同濃度供試溶液的流出時(shí)間無(wú)明顯差別，所作直線相關(guān)性較差，影響測(cè)定的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明稀釋倍數(shù)大于75，供試溶液 ηr值在1.4 ～2.5，濃度 c與 lnηr/c、ηsp/c間有較好的相關(guān)關(guān)系(相關(guān)系數(shù)大于0.98)，2條直線基本匯合于一點(diǎn)，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性較高。

根據(jù)擬合結(jié)果:［η］=(7.871+7.789)/2=7.830 L/g，k=20.670，β =8.787，帶入公式(3)得估算γ-PGA稀溶液濃度的公式(4):

圖1 γ-PGA水溶液黏度與濃度的關(guān)系

公式(4)適合于快速測(cè)定γ-PGA稀溶液的濃度，只需測(cè)定一個(gè)濃度下的γ-PGA稀溶液的相對(duì)黏度ηr，即可簡(jiǎn)便、快速并準(zhǔn)確測(cè)出 γ-PGA稀溶液的濃度。

需要說(shuō)明的是，對(duì)于不同菌株合成的γ-PGA分子量存在差異［1－2］，因此，特征黏度［η］以及參數(shù) k、β的值會(huì)有不同，但其推導(dǎo)和計(jì)算仍可參照以上方法，先采用外推法獲得［η］以及參數(shù)k、β的值，再代入公式(3)，即可獲得濃度C的計(jì)算公式。

2.2 發(fā)酵液γ-PGA含量的測(cè)定

根據(jù)GPC的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在γ-PGA合成旺盛的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期與穩(wěn)定期，Bacillus subtilis PGS-1合成的γ-PGA分子質(zhì)量基本維持不變(500Ku)，此外，發(fā)酵體系的pH基本維持在中性，因而發(fā)酵體系黏度的增加基本源于γ-PGA在胞外的積累。因此，可采用黏度法來(lái)估算發(fā)酵液γ-PGA含量。取培養(yǎng)48 h的發(fā)酵液稀釋不同倍數(shù)，分別采用黏度法與GPC法進(jìn)行γ-PGA含量的測(cè)定。

表2 發(fā)酵液γ-PGA含量測(cè)定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(表2)，不同稀釋倍數(shù)下，GPC法測(cè)得的結(jié)果變化不大(c＇GPC均值=16.96 g/L)，與之相比，黏度法的測(cè)定結(jié)果則出現(xiàn)了一定偏差。稀釋倍數(shù)＜200時(shí)，黏度法測(cè)定的結(jié)果偏差較大;隨稀釋倍數(shù)的增加，偏差逐漸減小;當(dāng)稀釋倍數(shù)≥200，發(fā)酵稀釋液的相對(duì)黏度在1.5～2.0之間時(shí)，黏度法測(cè)得的發(fā)酵液γ-PGA含量與GPC測(cè)定結(jié)果基本接近。出現(xiàn)這一結(jié)果可能是由于發(fā)酵液成分較為復(fù)雜，除γ-PGA外還含有大量無(wú)機(jī)和有機(jī)小分子的電解質(zhì)，會(huì)影響溶液中γ-PGA的懸浮狀態(tài)，稀釋倍數(shù)較低時(shí)，溶液中γ-PGA分子趨于聚集，因而以γ-PGA標(biāo)準(zhǔn)稀溶液的黏度測(cè)定作為依據(jù)的估算結(jié)果出現(xiàn)了較大偏差;但隨稀釋倍數(shù)的增加，電解質(zhì)的影響減弱，γ-PGA分子趨于分散，溶液性質(zhì)趨于均一，因而黏度法測(cè)得結(jié)果的偏差逐漸減小。

3 小結(jié)

與GPC法相比，黏度法測(cè)定γ-PGA含量?jī)H需烏氏黏度計(jì)、計(jì)時(shí)器等常規(guī)儀器即可進(jìn)行γ-PGA的定量，方法簡(jiǎn)便，適用性強(qiáng)，在儀器設(shè)備條件有限的情況下，黏度法可作為有效的替代方法進(jìn)行γ-PGA的定量，為γ-PGA的生產(chǎn)實(shí)踐及其應(yīng)用研究提供指導(dǎo)。此外，γ-PGA含量的黏度法測(cè)定還為其他水溶性大分子的定量方法提供了借鑒。

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Determination of γ-polyglutamic Acid Concentration by a Viscosity-assaying Method

Yao Jun1，Sun Rong-bin2，Wei Qin-jun1，Cao Xin1，Lu Ya-jie1
1(Department of Biotechnology，School of Basic Medical Science，Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China)2(School of Pharmacy，Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China)

ABSTRACTThe viscosity of γ-polyglutamic acid(γ-PGA)solution at different concentration was determined by ubbelohde viscometer.The intrinsic viscosity ［η］of γ-PGA was 7.830 L/g calculated from Huggins ＆Kraemer equation.Meanwhile，the correlation of relative viscosity(ηr)，specific viscosity(ηsp)and the γ-PGA concentration in aqueous solution was deduced.It was expected that the γ-PGA concentration could be facilely and precisely attained by the viscosity-assaying method.

γ-polyglutamic acid，viscosity，concentration

講師(孫榮斌實(shí)驗(yàn)師為通訊作者，Email:biotechnol@yeah.net)。

*江蘇省高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目(09KJB530007)。

2010－08－10，改回日期:2010－09－30