田萬敏 馬海樂 駱 琳 賈俊強(qiáng) 劉 斌 何榮海

超濾技術(shù)分離雙低油菜ACE抑制肽及其性能研究

田萬敏 馬海樂 駱 琳 賈俊強(qiáng) 劉 斌 何榮海

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013)

采用超濾技術(shù)對雙低油菜酶解物中的ACE抑制肽進(jìn)行了分離提純研究，考核了分離參數(shù)對分離效果的影響，分析了不同分子質(zhì)量段多肽HPLC肽譜的變化，研究了雙低油菜高ACE抑制活性多肽的耐消化性、酸堿穩(wěn)定性和耐熱性。結(jié)果表明，超濾分離能明顯提高雙低油菜ACE抑制肽的活性，截留分子質(zhì)量為3 ku的超濾膜透過液IC50值下降了15%，活性多肽回收率超過58%，酶解物中有4個高活性的組分峰，小于3 ku分子質(zhì)量段的ACE抑制肽有良好的耐熱性、酸堿穩(wěn)定性和耐消化性。

雙低油菜籽 ACE抑制肽 超濾 半抑制濃度 性能

高血壓是當(dāng)今世界五大常見疾病之一，抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)的活性是治療高血壓的重要途徑［1］。油菜是重要的油料作物之一，我國油菜和菜籽餅粕產(chǎn)量均居世界首位。雙低油菜籽粕中芥酸和硫代葡萄糖苷的含量均較低，具有作為食品資源開發(fā)利用的價值。但是目前絕大多數(shù)菜籽粕僅作為飼料使用。雙低油菜籽粕可以通過酶解反應(yīng)被應(yīng)用于制備ACE抑制肽［2］。就多肽的制備而言，酶解物的生物活性與其分子質(zhì)量大小有密切的關(guān)系。超濾技術(shù)是進(jìn)行蛋白酶解物中多肽分離純化簡單而有效的手段［3］。因此進(jìn)行雙低油菜籽粕酶解物的超濾技術(shù)研究，并對超濾產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性、耐酸堿性和抗腸道酶解能力等穩(wěn)定性特征進(jìn)行研究，為雙低油菜ACE抑制肽的開發(fā)利用提供理論和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1．1 材料與儀器

1．1．1 主要材料

雙低油菜籽餅粕:湖北老河口回天油脂有限公司;截留分子質(zhì)量為5 ku和3 ku的Pellicon系列纖維素平板膜，有效膜面積0．5 m2:Millipore公司;胃蛋白酶、胰蛋白酶:Amresco公司;馬尿酰組氨酰亮氨酸(Hip－h(huán)is－leu，HHL):Sigma公司;堿性蛋白酶(酶活40萬單位/g):無錫雪梅酶制劑有限公司;液相色譜所用試劑為色譜純，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。1．1．2 主要儀器

超聲處理系統(tǒng):自制;Pellicon小型超濾系統(tǒng):美國Millipore公司;蠕動泵:常州市誠和衛(wèi)生設(shè)備廠;HH型恒溫水浴鍋:江蘇金壇市中大儀器廠;Avanti TMJ－25型高速冷凍離心機(jī):美國Backman有限公司;LC－20AT高效液相色譜系統(tǒng):日本島津。

1．2 方法

1．2．1 雙低油菜ACE抑制肽的酶法制備

雙低油菜ACE抑制肽的制備按照本課題組已經(jīng)確立的條件進(jìn)行。雙低油菜籽餅粕蛋白經(jīng)超聲(料液質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、溫度20℃、超聲功率600 W/15 L)預(yù)處理40 min，用堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解參數(shù)為:pH 9．0、溫度50℃、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、加酶量(E/S)5%、酶解時間30 min。酶解完成后，沸水浴中滅酶10 min，經(jīng)3 500 r/min離心10 min收集上清液，噴霧干燥后備用。

1．2．2 超濾分離

稱取100 g噴霧干燥后產(chǎn)品，配成3%的多肽液，先經(jīng)過雙層濾紙(Φ9 cm)布氏抽濾，然后順序透過截流分子質(zhì)量為5 ku(第1級超濾)和3 ku(第2級超濾)的平板膜，分別得到分子質(zhì)量在5 ku以上、3～5 ku和3 ku以下的產(chǎn)物。以膜通量為指標(biāo)，考核壓力、多肽液溫度和濃度等參數(shù)對分離效果的影響。壓力由進(jìn)料蠕動泵流速控制，多肽液溫度由水浴鍋控制。

超濾過程的特性指標(biāo)主要是膜通量(Jv)，即單位時間內(nèi)通過單位膜面積濾過液的體積，計算如下:

式中:Ac為活性回收率/%;Mo為分離后組分的質(zhì)量/mg;Ro為分離后組分的IC50值/mg/mL;Mi為原料的質(zhì)量/mg;Ri為原料的IC50值/mg/mL。

1．2．3 雙低油菜ACE抑制肽的HPLC肽譜分析

蛋白質(zhì)或多肽在高效液相色譜(HPLC)或高效毛細(xì)管電泳(HPCE)上分離所得到的譜圖即為肽譜。這一方法常用于蛋白質(zhì)或多肽的鑒定以及突變點(diǎn)的檢測。高效液相色譜測定條件為:ZORBAX－C18柱(4．6×250 mm，填料粒徑5 μm)、柱溫28 ℃、檢測波長220 nm、進(jìn)樣量 10μL、洗脫液超純水 －乙腈(80%∶20%，各含0．5‰三氟乙酸)、流速 1 mL/min、洗脫時間25 min。

1．2．4 ACE抑制活性與半抑制濃度(IC50)的測定

IC50指抑制50%的ACE活性所需抑制劑的濃度［4］，是表征ACE抑制肽體外降血壓活性的主要指標(biāo)，IC50的測定依據(jù)吳瓊英等［5］的方法，采用高效液相色譜進(jìn)行檢測。

1．2．5 雙低油菜ACE抑制肽的體外消化試驗

參考陳季旺等［6］的方法進(jìn)行雙低油菜ACE抑制肽的體外消化試驗，具體操作:取超濾后活性最強(qiáng)的雙低油菜ACE抑制肽配制成一定濃度的溶液，取定量樣測定ACE抑制率。將溶液調(diào)節(jié)至pH 2．0后，加入2%(E/S)的胃蛋白酶，在37℃條件下保溫4 h，在沸水中保持10 min，使胃蛋白酶鈍化失活，將溶液調(diào)節(jié)至pH 8．1，取定量樣測定ACE抑制率。將剩余溶液加入2%(E/S)的胰蛋白酶，在37℃條件下保溫4 h，在沸水中保持10 min，使胰蛋白酶鈍化失活，取定量樣測定ACE抑制率。

1．2．6 雙低油菜ACE抑制肽的酸、堿穩(wěn)定性試驗

將超濾后活性最好的組分溶液pH分別調(diào)節(jié)至2．0、7．0、9．0、11．0，然后在 37 ℃保溫 0．5、1．0、1．5、2．0、3．0 h，測定其 ACE 抑制活性。

1．2．7 雙低油菜ACE抑制肽的熱穩(wěn)定性試驗

將超濾后活性最好的組分溶液調(diào)節(jié)至pH 7．0，分別在37、50、70、90 ℃處理 0．5、1．0、1．5、2．0、3．0 h，測定其ACE抑制活性。

式中:V為濾過液的體積/mL;A為膜的面積/m2;t為超濾時間/min。

超濾后各分子質(zhì)量段組分活性回收率的計算公式如下:

2 結(jié)果與分析

2．1 壓力對超濾膜通量的影響

在多肽液質(zhì)量濃度為3 mg/mL、第1級超濾溫度為45℃、第2級超濾溫度為35℃的條件下，不同操作壓力對超濾膜通量的影響如圖1所示。

圖1 操作壓力對膜通量的影響

從圖1中可以看出，隨著操作壓力的增加，2種截留膜的通量開始都逐漸增大。對于截留分子質(zhì)量為5 ku的膜，壓力在0．1～0．5 kg/cm2范圍內(nèi)，膜通量隨著操作壓力升高幾乎呈直線上升，壓力進(jìn)一步增加至0．7 kg/cm2時，膜通量增加趨于平緩。這主要是多肽液中的大分子溶質(zhì)在膜表面吸附積聚達(dá)到飽和濃度形成凝膠層和濃差極化快速增加［7］，導(dǎo)致有效的傳質(zhì)推動力下降，因此膜通量增長速率降低。對于截留分子質(zhì)量為3 ku的膜，壓力在0．1～0．7 kg/cm2范圍內(nèi)，膜通量隨著操作壓力升高幾乎呈線性上升，壓力進(jìn)一步增加至0．9 kg/cm2時，膜通量增加不顯著，這主要是第1級超濾后，大分子溶質(zhì)被截留下來，減少了凝膠層的厚度，因此第2級超濾壓力可以相應(yīng)增加。但是操作壓力過大時，除了增加能耗外，超濾過程也加重了膜的污染。因此選擇截留分子質(zhì)量5 ku的膜的操作壓力以0．5 kg/cm2為宜，選擇截留分子質(zhì)量3 ku的膜的操作壓力以0．7 kg/cm2為宜。

2．2 溫度對超濾膜通量的影響

在多肽液質(zhì)量濃度為3 mg/mL、第1級超濾壓力0．5 kg/cm2、第 2 級超濾壓力 0．7 kg/cm2的情況下，不同多肽液溫度對超濾膜通量的影響如圖2所示。隨著溫度的升高，2張膜的通量均增加，這主要是由于溫度升高，分子熱運(yùn)動加強(qiáng)，物料黏度下降，溶質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)增大，有利于減輕膜表面的濃差極化影響，傳質(zhì)系數(shù)增大，因此膜通量增加。對于截留分子質(zhì)量為5 ku的膜，當(dāng)溫度增加到45℃時，膜通量增加緩慢，與55℃的膜通量相比差別不大。對于截留分子質(zhì)量為3 ku的膜，當(dāng)溫度增加到35℃時，膜通量增加緩慢，與45℃的膜通量相比差別不大，雖然從45℃增加到55℃的過程中膜通量上升速率較快，但是過高的溫度不僅增加能耗而且還會損傷超濾膜及其殼體。從節(jié)約能源角度考慮，選擇截留分子質(zhì)量5 ku的膜的料液溫度以45℃為宜，選擇截留分子質(zhì)量3 ku的膜的料液溫度以35℃為宜。

圖2 多肽液溫度對膜通量的影響

2．3 多肽液濃度對超濾膜通量的影響

在第1級超濾壓力為0．5 kg/cm2、多肽液溫度為45℃，第2級超濾壓力為0．7 kg/cm2、多肽液溫度為35℃的條件下，不同多肽液濃度對超濾膜通量的影響如圖3所示。隨著多肽液濃度的升高，兩張膜的通量均降低，這主要是由于多肽是兩性化合物，有很強(qiáng)的表面活性，極易吸附在聚合物表面。多肽液溶質(zhì)濃度越大，黏度越大，擴(kuò)散系數(shù)小，且極容易形成凝膠層，減少膜通量的同時也增加了污染程度。對于截留分子質(zhì)量為5 ku的膜，當(dāng)多肽液質(zhì)量濃度達(dá)到3 mg/mL時，再增加多肽液濃度，膜通量急速下降。對于截留分子質(zhì)量為3 ku的膜，當(dāng)多肽液質(zhì)量濃度從1 mg/mL增加3 mg/mL時，膜通量下降速率較大，之后再增加多肽液濃度膜通量下降速率減緩?？紤]到生產(chǎn)工藝的合理性和經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)可行性，選取3%多肽液作為第1級和第2級超濾時溶液的基本濃度比較合適。

圖3 多肽液濃度對膜通量的影響

2．4 超濾后各分子質(zhì)量段多肽的回收率及其活性

超濾后各分子質(zhì)量肽段的回收率和IC50值見表1，活性肽總回收率合計為76．44%，其余23．56%主要因超濾操作中管道料液殘存所致。從表1中可見，隨著截留分子質(zhì)量的減小，超濾物的ACE抑制活性逐漸增高，高活性肽分子質(zhì)量主要集中在3 ku以下，IC50值從母液的2．0 mg/mL 下降到 1．72 mg/mL，活性肽回收率也高達(dá)58．4%。其他研究結(jié)果也表明ACE抑制肽主要是一些小分子的多肽［8］。

表1 不同分子質(zhì)量段活性肽的回收率及IC50值

2．5 超濾后各分子質(zhì)量段多肽的肽譜

雙低油菜ACE抑制肽經(jīng)截留分子質(zhì)量為5 ku和3 ku的膜過濾后所得的各分子質(zhì)量段的ACE抑制肽的肽譜如圖4所示。超濾前雙低油菜ACE抑制肽主要有4個組分峰，其保留時間分別為2．0、3．0、5．0、6．0 min。經(jīng)過5 ku 的膜過濾后，分子質(zhì)量大于5 ku的ACE抑制肽在2．0、3．0 min出的組分峰面積下降很多，5．0、6．0 min出的組分峰幾乎消失。經(jīng)過3 ku的膜過濾后，分子質(zhì)量在3～5 ku以及小于3 ku的ACE抑制肽在2．0、3．0 min出的組分峰面積明顯高于未過膜的ACE抑制肽，5．0、6．0 min出的組分峰相對于未過膜的ACE抑制肽峰面積有所增加。從肽譜可以直觀地看出，經(jīng)過2個分子質(zhì)量截留膜過濾后各分子質(zhì)量ACE抑制肽的組分有了顯著地變化，且有效的活性組分應(yīng)該在這4個組分峰里。

圖4 超濾后各分子質(zhì)量雙低油菜ACE抑制肽的高效液相色譜

2．6 雙低油菜ACE抑制肽的體外消化試驗

分子質(zhì)量小于3 ku的雙低油菜ACE抑制肽與胃蛋白酶、胰蛋白酶等腸道酶作用后產(chǎn)物對ACE的抑制活性效果如圖5所示。雙低油菜ACE抑制肽與胃蛋白酶作用后其對ACE抑制率略微升高，說明雙低油菜ACE抑制肽在胃蛋白酶作用下，有可能水解液中原來對ACE具有抑制活性效果的活性組分，或者是一些原來對ACE沒有抑制效果的長分子肽鏈與胃蛋白酶反應(yīng)后產(chǎn)生了活性更高、新的ACE抑制肽。

圖5 腸道酶降解雙低油菜ACE抑制肽對ACE的抑制效果

胃蛋白酶作用后的產(chǎn)物與胰蛋白酶作用后，產(chǎn)物被進(jìn)一步降解，其對ACE抑制率下降較多，說明雙低油菜ACE抑制肽雖能抵抗胃蛋白酶的降解，但其中較多活性組分卻不能抵抗胰蛋白酶的降解作用，從而導(dǎo)致產(chǎn)物對ACE的抑制活性有所下降，但即便如此，其對ACE抑制率仍能保持未消化前的84．48%，說明對雙低油菜ACE抑制肽具有良好的抗腸道消化的能力，經(jīng)口服后很可能繼續(xù)保持降血壓作用。

雙低油菜ACE抑制肽經(jīng)消化酶降解后的肽譜見圖6。雙低油菜ACE抑制肽經(jīng)胃蛋白酶作用后的HPLC譜圖與原液相比，3．0 min時出峰，其峰高、峰面積明顯降低，再經(jīng)胰蛋白酶作用后該峰的峰高、峰面積進(jìn)一步降低，且經(jīng)胰蛋白酶消化后，未經(jīng)消化酶作用的原液在5．0～6．0 min之間的2個小峰消失，并出現(xiàn)1個峰面積較大的峰，這譜圖的變化也可以說明胃蛋白酶、胰蛋白酶等腸道消化酶對雙低油菜ACE抑制肽的降血壓活性有一定的消解作用。

圖6 腸道酶消化后雙低油菜ACE抑制肽的高效液相色譜

2．7 pH對雙低油菜ACE抑制肽活性影響

取分子質(zhì)量小于3 ku的雙低油菜ACE抑制肽進(jìn)行耐酸堿試驗，pH對雙低油菜ACE抑制肽活性影響如圖7所示。當(dāng)pH為2．0時，雙低油菜ACE抑制肽的ACE抑制率隨著時間的延長顯著下降，3 h時下降為初始時的69．37%。當(dāng)pH為7．0時，雙低油菜ACE抑制肽活性隨著時間的延長幾乎不變，3 h時保留有初始96．28%的活性;當(dāng)pH分別為9．0和11．0時，活性損失不多，在保留3 h后，ACE抑制活性分別保留有初始值的90．15%和83．13%。由此可以看出，雙低油菜ACE抑制肽具有良好的酸堿穩(wěn)定性，在中性條件下保存或者使用時活性穩(wěn)定。這一結(jié)果與丁青芝等［9］在研究米糠蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物的酸堿性試驗中的發(fā)現(xiàn)基本一致。

圖7 pH對雙低油菜ACE抑制肽活性影響

2．8 不同溫度對雙低油菜ACE抑制肽活性影響

取分子質(zhì)量小于3 ku的雙低油菜ACE抑制肽進(jìn)行保溫試驗，不同溫度對雙低油菜ACE抑制肽活性影響如圖8所示。

圖8 溫度對雙低油菜ACE抑制肽活性影響

從圖8可以看出，當(dāng)保存溫度為37℃時，在整個保存過程中，雙低油菜ACE抑制肽的活性隨著時間的延長幾乎保持不變，在3 h時ACE抑制活性還保留有初始時的96．85%;當(dāng)保存溫度為50～90℃時，雙低油菜ACE抑制肽的活性隨著時間的延長逐漸下降，3 h時ACE抑制活性保留有初始時的84．58% ～75．54%。結(jié)果表明:雙低油菜ACE抑制肽具有良好的熱穩(wěn)定性，在實際生產(chǎn)中能滿足高溫殺菌等工藝要求，在常溫下保存或者使用時活性穩(wěn)定。這一結(jié)果與I－Chuan Sheih等［10］在研究水藻廢物蛋白酶解產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性試驗的發(fā)現(xiàn)基本一致。

3 結(jié)論

3．1 對于截留分子質(zhì)量為5 ku的第一級超濾分離而言，操作壓力為0．5 kg/cm2、多肽液溫度為45℃、多肽液質(zhì)量濃度為3 mg/mL時具有較高的膜通量;對于截留分子質(zhì)量為3 ku的第二級超濾分離，操作壓力為0．7 kg/cm2、多肽液溫度為35℃、多肽液質(zhì)量濃度為3 mg/mL時具有較好的膜通量。

3．2 雙低油菜酶解物中高ACE抑制活性多肽的分子質(zhì)量主要集中在3 ku以下，IC50值為1．72 mg/mL。

3．3 雙低油菜ACE抑制肽具有較好的抗胃腸道酶解性，經(jīng)腸道模擬消化后，其ACE抑制活性保留初始時的84．48%以上。

3．4 雙低油菜ACE抑制肽具有良好的熱穩(wěn)定性及酸堿穩(wěn)定性，極端條件如高溫，強(qiáng)酸性和強(qiáng)堿性條件下保留3 h時，其ACE抑制活性保留值在初始時的75．54%以上。

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Study on Purification of Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory Peptides from Double－low Rapeseed by Ultrafiltration and its Properties

Tian Wanmin Ma Haile Luo Lin Jia Junqiang Liu Bin He Ronghai
(School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013)

The ultrafiltration Tech－nology was adopted for the separation of angiotensin converting enzyme inhibitory peptides from double－low rapeseed hydrolysate and the influence of separation parameters on the purification effect was investigated．The change of the peptide mapping of different molecular weight peptides was analyzed and the properties of digestion resistance，heat resistance and pH stability of the higher activity peptides from double－ low rapeseed were studied as well．The results showed that the ultrafiltration could raise the activity of the ACE inhibitory peptides from double－low rapeseed markedly，the IC50value of permeate liquid of 3 ku membrane was decreased by 15%，the recovery rate of active peptides reached more than 58%，there were four high activity component peaks in the hydrolysate，the ACE inhibitory peptides with molecular weight lower than 3 ku retained activity under various temperature and pH treatments，and showed resistance to in vitro digestion．

double － low rapeseed，ACE inhibitory peptides，ultrafiltration，IC50，properties

TS201．2

A

1003－0174(2011)09－0087－05

江蘇省科技成果轉(zhuǎn)化專項資金(BA2008100)

2010－10－12

田萬敏，男，1985年出生，碩士，食品生物技術(shù)

馬海樂，男，1963年出生，博士，教授，博士生導(dǎo)師，食品生物技術(shù)