李華沖，晏菊芳, 蘇小燕, 孔令強, 楊大成

(1． 西南大學 化學化工學院，重慶 400715； 2． 成都地奧制藥集團 藥物篩選中心，四川 成都 610041)

選用價廉易得的天然原料,采用相對簡單的合成方法制備結構新穎的抗糖尿病藥物,是化學與藥學工作者的艱巨任務。

苯甘氨酸衍生物用途廣泛,如D-對羥基苯甘氨酸是β-內酰胺類半合成抗生素的側鏈,用于生產如阿莫西林、頭孢羥氨芐等抗生素藥物[1]；氯代苯甘氨酸衍生物不僅用于抗菌類藥物、抗血栓類藥物以及農藥等的制備,而且還用于青霉素類衍生物、頭孢菌素類衍生物的合成[2]等。但到目前為止,苯甘氨酸及其衍生物作為抗糖尿病藥物的研究還未見文獻報道。

本文借鑒具有強的PPARγ激動活性的L-酪氨酸衍生物的結構特征[3],設計了L-間氨基苯甘氨酸作為關鍵中間體,通過對其結構的進一步修飾制得具有多種結構特點的L-間氨基苯甘氨酸衍生物,經過抗糖尿病活性篩選,期望得到具有抗糖尿病活性的先導化合物。

本文以L-苯甘氨酸為原料,通過苯環(huán)硝化[4～6]、α-氨基保護[4,5,7～9]、羧基保護[10]及硝基還原[11～14]等反應,合成了中間體L-間硝基苯甘氨酸衍生物(1，2a～2c和5c),產物L-間氨基苯甘氨酸(4)和L-間氨基苯甘氨酸衍生物(3a～3c,6c)(Scheme 1)，其中2b,5c, 3b,3c及6c為新化合物，其結構經1H NMR，13C NMR及MS表征。初步測試了部分化合物的抗糖尿病活性。

CompabcRBocFmocCbz

Scheme1

1 實驗部分

1．1 儀器與試劑

X-6型精密顯微熔點儀；WZZ-2S型自動旋光儀；AV-300型超導核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內標)；GX型FT-IR紅外光譜儀(KBr壓片)；Agilent 1946B MS(ESI MS)型質譜儀。

1[6]按文獻方法合成；L-苯甘氨酸(L-Phg)，芐基琥珀酰亞胺基碳酸酯(Z-OSu)，二叔丁氧基碳酸酐(Boc2O)和9-芴甲基丁二酰亞胺基碳酸酯(Fmoc-OSu)，分析純，成都凱泰新技術有限責任公司；其余所用試劑均為市售分析純。

1．2 合成

(1) 2的合成通法[8，9]

在反應瓶中加入1 2 mmol, 10%Na2CO3溶液或10%K2CO3溶液5 mL,冰浴冷卻下攪拌使其溶解；緩慢滴加Fmoc-OSu 1.96 mmol(或Z-OSu 2.2 mmol,或Boc2O 2.4 mmol)的丙酮(3.5 mL)溶液,滴畢,于20 ℃～30 ℃反應至終點(TLC跟蹤,pH 9～10)。加適量水稀釋，分液，水層用乙醚(3×5 mL)萃取。冰浴冷卻下，水相用2 mol·L-1HCl調至pH 3～4,減壓蒸除丙酮，殘余物用乙酸乙酯(3×10 mL)萃取,合并萃取液，用飽和NaCl溶液洗至中性，無水MgSO4干燥，減壓蒸除乙酸乙酯得2a～2c。

2a： 淡黃色固體，收率83.2%，m.p.143 ℃～150 ℃，[α]+72°(c1.0, CH3OH)。

2b： 類白色固體，收率87.4%，m.p.101.4 ℃～105.6 ℃，[α]+43.8°(c2.4, DMF);1H NMRδ: 4.24～4.32(m, 1H, CH), 4.35(s, 2H, CH2), 5.45(d,J=7.95 Hz, 1H, CH), 7.28～7.35(m, 2H, ArH), 7.39～7.44(m, 2H, ArH), 7.68(d,J=7.65 Hz, 1H, ArH), 7.75(d,J=7.20 Hz, 2H, ArH), 7.88～7.90(m, 3H, ArH, CONH), 8.20(d,J=7.83 Hz, 1H, ArH), 8.36(s, 1H, ArH), 8.47(d,J=8.04 Hz, 1H, ArH), 13.24(s, 1H, CO2H);13C NMRδ: 46.6, 57.2, 66.0, 120.1, 122.4, 122.9, 125.3, 127.1, 127.7, 130.0, 134.8, 139.8, 140.8, 143.7, 143.8, 147.8, 155.9, 171.2; ESI-MSm/z: 441.2{[M+Na]+}。

2c： 黃色固體，收率97.9%，m.p.72.5 ℃～74.3 ℃，[α]+122.0°(c2.0, CHCl3)； ESI-MSm/z: 331.2{[M+H]+}。

(2) 5c的合成[10]

在反應瓶中加入2c5 mmol和乙酸乙酯10 mL,攪拌使其溶解；滴加三乙胺0.7 mL和芐溴5 mmol,滴畢，于75 ℃回流反應至終點(TLC跟蹤)。過濾，濾餅用乙酸乙酯(3×5 mL)洗滌，合并濾液與洗液，依次用5%NaHCO3溶液、飽和NaCl溶液各洗兩次，用無水MgSO4干燥，減壓蒸除溶劑，殘余物用混合溶劑[V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=1∶3]重結晶得白色固體5c，收率86.2%，m.p.120.1 ℃～123.6 ℃;1H NMRδ： 5.03(s, 2H, CH2), 5.06(s, 2H, CH2), 5.51(d,J=6.0 Hz, 1H, CH), 6.08(d,J=3.0 Hz, 1H, CONH), 7.18～7.71(m, 12H, ArH), 8.19～8.22(m, 2H, ArH);13C NMRδ: 57.2, 65.9, 66.7, 122.7, 123.1, 127.7, 127.8, 127.9, 128.1, 128.4, 130.1, 134.9, 135.6, 136.7, 139.6, 147.7, 155.9, 169.8; ESI-MSm/z: 421.0{[M+H]+}, 443.0{[M+Na]+}。

(3) 3，4和6c的合成通法

方法一(Zn/NH4Cl/HOAc還原法)： 在圓底燒瓶中加入Zn粉8.9 mmol，NH4Cl 0.2 mmol，2 1.0 mmol及80%乙醇20 mL,攪拌下于65 ℃反應0.5 h～1.0 h；加冰乙酸4.0 mmol，于65 ℃反應至終點(TLC監(jiān)測)。過濾，濾餅依次用飽和Na2CO3溶液(1×5 mL)，飽和NaCl溶液(3×5 mL)洗滌。后處理方法：①濾液用氨水調至pH 5～6,有大量淡黃色沉淀析出,抽濾,濾餅干燥得黃色固體4； ②濾液用飽和Na2CO3溶液調至pH 9～10后用乙醚(3×10 mL)萃取,水層加入乙酸乙酯20mL,在冰浴下用2 mol·L-1HCl調至pH 3～4,用乙酸乙酯萃取(3×10 mL),合并有機層,用飽和NaCl溶液(3×5 mL)洗滌,無水MgSO4干燥,減壓蒸除乙酸乙酯得3和6。

方法二(Zn/CaCl2還原法)： 參照文獻[12]方法合成3，4和6c。

3a： 淡黃色固體，收率82.5%，m.p.109 ℃～120 ℃，[α]+86°(c1.0, CH3OH)； ESI-MSm/z: 319.2{[M+Na]+}。

3b： 淡黃色固體，收率85.5%，m.p.124.3 ℃～130.8 ℃，[α]+89.5°(c2.0, DMF)；1H NMRδ: 4.23～4.29(m, 3H, CH, CH2), 4.90～4.95(m, 1H, CH), 6.50～7.90(m, 12H, ArH), 8.09(s, 1H, CONH);13C NMRδ: 46.6, 58.4, 66.0, 113.3, 113.6, 115.1, 120.1, 123.6, 125.6, 127.1, 127.7, 128.7, 129.0, 137.5, 140.7, 143.8, 143.9, 143.8, 148.6, 148.8, 155.9, 172.3, 172.9; IRν: 3 446(CONH), 3 307(NH2), 1 687(C=O), 1 604，1 496(C=C) cm-1； ESI-MSm/z: 389.2{[M+H]+}，411.1{[M+Na]+}。

3c： 淡黃色固體，收率85.8%，m.p.74.3 ℃～80.6 ℃，[α]+81.36°(c2.2, DMF);1H NMRδ: 4.68(s, 1H, CH), 4.90(s, 2H, NH2), 5.03(s, 2H, CH2), 6.38(d,J=7.50 Hz, 2H, ArH), 6.43～7.34(m, 7H, ArH);13C NMRδ: 57.9, 65.5 113.6, 115.0, 121.5, 127.7, 127.8, 128.4, 129.0, 137.0, 137.5, 151.9, 155.9, 172.2; ESI-MSm/z: 301.1{[M+H]+}, 323.1{[M+Na]+}。

4： 淡黃色固體，收率85.4%，m.p.194.5 ℃～203.4 ℃，[α]+31.8°(c1.1, 2 mol·L-1HCl)。

6c： 白色固體，收率81.8%，m.p.59.8 ℃～64.5 ℃;1H NMRδ: 5.06(s, 2H, CH2), 5.09(s, 2H, CH2), 5.12～5.14(m, 1H, CH), 5.16(s, 2H, NH2), 6.51(d,J=7.60 Hz, 2H, ArH), 6.58(s, 1H, ArH), 6.95～7.00(m, 1H, ArH), 7.26～7.35(m, 10H, ArH), 8.20(d,J=7.50 Hz, 1H, CONH);13C NMRδ: 58.5, 65.7, 66.1, 113.3, 113.8, 115.0, 127.6, 127.8, 127.9, 128.0, 128.4, 129.1, 135.9, 136.5, 137.0, 149.0, 156.0, 170.9; ESI-MSm/z: 391.1{[M+H]+}, 413.0{[M+Na]+}。

1．3 PPAR反應元件(PPRE)激動活性檢測

將HepG2肝癌細胞常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃，5%CO2，含100 U·mL-1鏈霉素和青霉素的低糖DMEM中，在1.5×104個/孔接種于96孔板后培養(yǎng)過夜,參照轉染試劑說明書進行質粒轉染。轉染的質粒包括帶有PPRE和螢火蟲熒光素酶報告基因的質粒pPPRE-Luc,及用作轉染內參照的帶有海腎熒光素酶的質粒phRL-TK,轉染24 h后換用含待測樣品的培養(yǎng)基,同時設立空白對照(未轉染的細胞)、陰性對照(轉染的細胞不加樣品)和陽性對照[轉染的細胞加入匹格列酮(Pioglitazone)]，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(Promega)檢測熒光素酶活性,根據檢測到的化學發(fā)光強度L值計算激動率PPRE{PPRE=[(L1樣品-L1空白)/(L1陰性-L1空白)]/[(L2樣品-L2空白)/(L2陰性-L2空白)]×100%，其中：L1為螢火蟲熒光素酶的化學發(fā)光強度,L2為內參照海腎熒光素酶的化學發(fā)光強度；樣品檢測濃度為10 μg·mL-1,檢測時設雙復孔,重復兩次}，數(shù)據見表5。

2 結果與討論

以L-苯甘氨酸為原料,先硝化得中間體1，對其α-氨基進行保護(Boc，F(xiàn)moc和Z)得2a～2c； 對2c的羧基進一步芐基化得5；2a～2c的硝基還原得3a～3c。

2．1 合成工藝研究

(1)2a～2c： 以Boc2O為?；瘎?0%K2CO3為堿，在1 2.0 mmol,n(1)∶n(Boc2O)=1．0 ∶1.2條件下于30 ℃反應27.9 h，2a的收率達82．5%；放大實驗20倍，最高收率達96．1%。

以Fmoc-OSu為?；瘎?10%K2CO3為堿,在THF/H2O為溶劑，pH=9～10, 1 5.0 mmol,n(1)∶n(Fmoc-OSu)=1．00∶0.98的條件下于20 ℃反應0.7 h,2b收率達88.0%。 放大實驗5倍或10倍,收率分別為88．4%和88．8%，且產物色澤很好。

以Z-OSu為?；瘎?10%K2CO3為堿，1 5.0 mmol,n(1)∶n(Z-OSu)=1．0∶1.1，在丙酮/H2O中于30 ℃反應約40 h,收率達97.9%。放大反應10倍，收率不變。

(2) 4： 以Zn/NH4Cl/AcOH為還原劑，TLC跟蹤顯示還原很完全。但采用萃取法進行后處理,收率只有10%左右。TLC分析發(fā)現(xiàn),4主要留在水相。考慮4易于形成內鹽或分子間鹽,作者采用調節(jié)濾液pH的方法,發(fā)現(xiàn)有大量淡黃色沉淀析出,由此簡易地實現(xiàn)了產物的分離純化，結果見表1。

(3)3a： 考慮到Boc基團的穩(wěn)定性,實驗采用水合肼還原[13]2a制備3a,收率低于30%。后選擇了弱酸性的Zn/NH4Cl/AcOH還原體系,但還原產物復雜,存在Boc基團脫落的情況；進一步弱化體系的酸性,嘗試了中性的Zn/CaCl2還原法,發(fā)現(xiàn)還原的最低收率也達到79.4%(表2)。 由表2可見，Zn/CaCl2還原2a制備3a具有反應條件溫和、操作簡單等優(yōu)點,具有較好工業(yè)價值。

(4)3b： 參照文獻[10]的方法將2b和試劑分次加入,發(fā)現(xiàn)Zn粉和原料會附著在反應瓶上,反應不均勻,收率最高只有33.3%。對文獻[10]方法進行改進,采用所有反應物一次性加入的方式,但收率仍然很低(<23.3%),推測是AcOH使反應物黏在一起導致反應效果不好。 參照文獻[12]方法將CaCl2改為NH4Cl而且不加AcOH后,TLC分析發(fā)現(xiàn),除了產物點外還有一個雜質點。我們認為,在沒加AcOH的情況下,體系酸度不夠,反應不徹底,有部分產物停留在中間體狀態(tài)。由此認為加酸對該反應是必要的,故嘗試在反應約30 min后再添加AcOH的分段投料方法。該方法不僅收率超過84.0%,而且能直接得到純品。究其原因,是因為此種投料方式,不僅解決了Zn粉和原料附著在瓶壁的關鍵問題,而且調整了反應體系不同階段的酸度,保證了硝基的徹底還原。

表1 4的制備條件與結果

a1 4.8 mmol，b1 24.0 mmol,其余反應條件同1．2(3)

表2 3a的制備條件與結果

a2a1.6 mmol,b2a3.2 mmol,c2a10.1 mmol,其余反應條件同1.2(3)

表3 3c的制備條件與結果

a2c1.6 mmol,b2c6.3 mmol,c2c30.0 mmol,d2c26.4 mmol,其余反應條件同1.2(3)

(5)3c：2b按照Zn/NH4Cl/AcOH還原法可以高收率地得到產物3b,但2c同法還原制備3c,收率最高只有45.2%。為了高收率地得到3c,嘗試了Zn/CaCl2還原法，結果結果表明，Zn/CaCl2還原法同樣適宜于3c的合成。

(6) 6c： Zn/NH4Cl/AcOH和Zn/CaCl2還原法都有較強的還原能力,本文采用Zn/NH4Cl/AcOH體系對5c還原為6c，獲得了成功,結果見表4。

表4 6c的制備條件與結果

a5c1.2 mmol，b5c2.4 mmol,c5c4.8 mmol,其余反應條件同1．2(3)

綜上所述，從硝基苯甘氨酸及其衍生物還原目標分子,看起來很簡單,但制備中卻出現(xiàn)不少困難。起初的收率大多低于45%,且產物很難純化。通過條件探索,可以穩(wěn)定地獲取高純度高收率的目標分子,為后續(xù)研究奠定了基礎。

2．2 生物活性結果

測定了1～6的PPRE數(shù)據來判定其抗糖尿病的活性，結果見表5。表5顯示，在測定濃度極低的條件下,其中6個化合物依然顯示出一定的PPRE激動活性；5個化合物的生物活性達到了10.0%以上(3c和6c的活性分別達到了30.0%和22.8%)；2b,2c和3a的活性相近(14.0%左右)；5c和3b活性依次降低。分子結構的ChemDraw3D模擬(Chart 1)發(fā)現(xiàn),3c和6c的芳香環(huán)處于不同平面內,具有一定的剛性,與吡格列酮有一定的相似性，但是活性差別很大。郭宗儒等[15]指出,配體分子要表現(xiàn)出好的PPARγ活性,必須以U形構象結合在PPAR受體腔內。因此我們推測：3c和6很可能沒有以U形構象進入受體腔,因而顯示出很低的PPRE激動活性。這些結果提醒我們,要獲取活性好的抗糖尿病分子,結構上要盡可能與具有強的PPARγ激動活性的L-酪氨酸衍生物的結構特征一致,亦即必須在3c和6c的苯環(huán)氨基引入疏水結構單元。按此思路,作者合成了另外一些L-間氨基苯甘氨酸的苯環(huán)氨基修飾物,多種模型上的抗糖尿病活性研究顯示,某些分子的活性確實增強(結果另文發(fā)表)。

表5 化合物的PPRE活性數(shù)據*

Chart 1

3 結論

以L-苯甘氨酸為原料,合成了9個L-苯甘氨酸衍生物，其中5個為新化合物。工藝研究結果表明，該方法具有合成方法簡便、成本低廉、收率穩(wěn)定優(yōu)良等優(yōu)點,具有較高的工業(yè)應用價值。

致謝：亢為和王寧老師測定IR和NMR,在此深表謝意！

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