姬新穎，李 濤，劉瑞敏，白慧玲，牛保華，婁 強，馬遠方

（河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 河南省細胞與分子免疫學(xué)重點實驗室，河南 開封475004）

在動脈粥樣硬化發(fā)生機制中，免疫學(xué)說越來越引起人們的重視。在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中，諸如氧化型低密度脂蛋白、熱休克蛋白、病原微生物和β3糖蛋白Ⅰ等相關(guān)抗原與抗體相繼被發(fā)現(xiàn)證實由上述抗原或抗體誘發(fā)的免疫反應(yīng)，包括天然免疫和獲得性免疫都在動脈粥樣硬化過程中起作用，尤其是在早期。研究發(fā)現(xiàn)免疫細胞在粥樣硬化斑塊中聚集，說明免疫在動脈粥樣硬化發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中也起作用。加強動脈粥樣硬化免疫機制的研究，確定動脈粥樣硬化的免疫學(xué)性質(zhì)，尤其探索天然免疫在動脈粥樣硬化發(fā)生早期的作用，有助于徹底闡明動脈粥樣硬化的發(fā)生機制。動脈粥樣硬化是一種漸進的、復(fù)雜的、無痛感的組織病變過程，是心腦血管系統(tǒng)的常見疾病。近年來發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化過程除了與傳統(tǒng)的動脈粥樣硬化危險因素有關(guān)外，還與感染、炎癥和自身免疫等因素有關(guān)。動脈粥樣硬化的發(fā)生完全符合Witebsky和Rose提出的關(guān)于自身免疫疾病的四條規(guī)則。免疫系統(tǒng)的各個成員（細胞因子、自體抗原、自體抗體）在動脈粥樣硬化形成過程中起著同樣重要的作用。

血液流經(jīng)血管主要產(chǎn)生2種機械力——WSS和CS。前者與血管長軸平行，作用于血管內(nèi)皮細胞（EC），后者是垂直于血管壁的環(huán)形張力，作用于血管壁所有細胞，包括內(nèi)膜EC、中膜平滑肌細胞（SMC）和外膜成纖維細胞［1－2］。血流對血管內(nèi)皮細胞的作用力WSS被認(rèn)為在引起血管張力和內(nèi)徑改變，血管壁慢性重塑和動脈疾病（動脈粥樣硬化和內(nèi)膜增生）方面起著非常突出的作用［3－4］。由于 WSS是如此重要的血管機械力，所以美國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會原主席，國際心血管動力學(xué)研究權(quán)威Tarbell教授率領(lǐng)的研究組研究多年，致力于搞清何種力可以影響WSS的幅度、時間和空間分布，及其對內(nèi)皮細胞所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)。

圖1 作用于內(nèi)皮細胞單層的應(yīng)力模式示意圖

1 SPA研究的歷史

Tarbell小組首先研究了血管幾何學(xué)效應(yīng)（如血管彎曲，分枝，吻合［5－6］，血流搏動［7］，血液流變學(xué)［8］和血管壁彈性［9］。他們建立了冠狀動脈的彈性彎曲管狀模型［10］，彈性吻合模型［5］，彈性主動脈分枝模型［10－11］和彈性頸動脈分枝模型［12］。這些研究使人們深刻認(rèn)識到這樣一個事實，即除了WSS之外，EC同時也經(jīng)受機械牽張力的作用（周圍應(yīng)力circumferential stresses或者環(huán)狀應(yīng)力hoop stresses），這種力是由搏動血管內(nèi)的周圍牽拉造成的。

這些開創(chuàng)性的研究使我們認(rèn)識到，WSS和CS并不總是處于空間同相位（in phase temporally）；為了說明 這 個 相 外／出 相 （out-of-phase）或 者 不 同 相（asynchronous）的現(xiàn)象，Tarbell教授引入了應(yīng)力相位角（stress phase angle，SPA）的概念（圖1）。SPA是CS與WSS之間的相位角，而CS是與血管直徑的改變同步的［10］。直到今天，依然只有6篇相關(guān)的文獻報導(dǎo)。其中5篇屬于我們在內(nèi)的Tarbell課題組［12－15］，另一篇則由英國科學(xué)家［16］發(fā)表。

這些有關(guān)彈性血管的模擬研究揭示，最容易出現(xiàn)動脈粥樣硬化和內(nèi)膜增生的循環(huán)區(qū)，如彎曲血管內(nèi)壁，分枝血管外壁，移植血管的遠端吻合處，也是WSS與CS最不同步的部位（SPA離0度最遠）。事實上，體內(nèi)動脈粥樣硬化最顯著的地方，如冠狀動脈和頸內(nèi)動脈分枝外側(cè)壁，在循環(huán)中表現(xiàn)最不同步，即SPA接近于－180°［10］，上述這些研究和其他有關(guān)的研究［17－18］顯示，彎曲血管內(nèi)壁，分枝血管外壁，移植血管的遠端吻合處的平均WSS相對較低，振動剪切指數(shù)（用來測定振動剪切力在血液循環(huán)周期中反轉(zhuǎn)方向的指標(biāo)，oscillatory shear index，OSI）較高。實際上，與不同相SPA相比，作為動脈粥樣硬化時血流動力學(xué)的局部因素，平均 WSS較低，而OSI較高的情況得到了人們更多的關(guān)注。

因此，這些流體機械觀測結(jié)果促使我們提出問題：面對同時出現(xiàn)的 WSS和CS時，SPA是否能夠?qū)C的生物學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生任何影響？10年前，Tarbell小組首先報導(dǎo)了實驗方法來證明這個問題［10］。他們將牛主動脈內(nèi)皮細胞（BAEC）培養(yǎng)在彈性管的內(nèi)壁，然后給細胞施加同樣的外力：WSS10±10dynes／cm2，CS10±4dyn／cm2，SPA分別為－15°或－100°，作用時間為4h。相比于SPA－15°，不同步的程度較高（SPA為－100°）時，誘導(dǎo)出血管收縮劑內(nèi)皮素1（ET1）的生成，而抑制血管擴張劑NO和前列環(huán)素（PGI2）的產(chǎn)生。由于ET-1具有促動脈粥樣硬化作用，而NO和PGI2則有抗動脈粥樣硬化作用，所以該項體外資料提供了循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)疾病易患區(qū)的非同步血流動力學(xué)特點與內(nèi)皮細胞促動脈粥樣硬化性生物反應(yīng)的聯(lián)系。該研究也顯示，當(dāng)用硬外套緊緊地包住彈力管以防管壁伸縮，并施加同樣的剪應(yīng)力波形時，PGI2、NO和ET-1的產(chǎn)生水平幾乎與無外套包繞時的非同步情況一致。近來，約翰霍普金森大學(xué)的David Kass小組［19］研究了搏動性血流對培養(yǎng)在硬管或軟管內(nèi)的BAEC細胞的影響，并對二者進行了比較。結(jié)果提示，與軟管相比，硬管抑制依賴Akt的抗凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。盡管該文并未談及SPA或相位角的影響，但是從該課題組［20］較早前的文章可以很清楚地看出，軟管的牽拉和剪切幾乎是同相的。因此，我們提出如下的假設(shè)，Kass小組所用的軟管能夠誘導(dǎo)出和硬管相似的細胞反應(yīng)，即促動脈粥樣硬化性反應(yīng)。

為進一步確認(rèn)非同步血流動力學(xué)和內(nèi)皮細胞的生物學(xué)反應(yīng)，Tarbell小組研制出了新的血流動力學(xué)模擬儀（hemodynamic simulator）。該儀器能夠產(chǎn)生出更加寬泛的SPA［14］。將BAEC細胞用該儀器處理5h和12h（SPA為0°和－180°），然后測定基因表達水平（ET-1，eNOS，COX-2）和相關(guān)的產(chǎn)物（ET-1，NO，PGI2），以及細胞間連接蛋白（occludin，ZO-1，VE-cadherin）。觀察到SPA對基因表達有重要影響，這就更加支持其假設(shè)，即WSS和CS不同步時，具有促動脈粥樣硬化作用。只有很少一些其他研究小組也注意到了同步WSS和CS對內(nèi)皮細胞行為的影響［21－23］，但是他們沒有意識到SPA 的重要性，也沒有描述SPA的特點。從這些研究使用的血流環(huán)的性質(zhì)，我們認(rèn)為，其SPA接近0°，不可能像Tarbell課題組的研究那樣達到高度不同步（－180°）。Kamm實驗室［24］也設(shè)計出一種儀器從肺外壓迫靜脈，研究短暫血流和血管變形情況下的NO產(chǎn)生水平。但是從其研究方法的介紹部分，可以清楚地看出，血管變性和剪切力幾乎是同相的。所以，關(guān)于SPA的假設(shè)是一項理論創(chuàng)新，需要很多的實驗結(jié)果來進一步驗證，需要不同領(lǐng)域的科學(xué)家來共同探討，我們的目的就是在Tarbell教授的研究基礎(chǔ)之上，全面了解不同步SPA（－180°）的致病機理，為搞清血流動力學(xué)與基因表達的關(guān)系，找到與動脈粥樣硬化發(fā)病最密切關(guān)聯(lián)的基因，篩選能夠改變血管內(nèi)皮細胞基因表達譜的藥物，如CLA等。

2 血流動力學(xué)新概念SPA的研究價值

人們普遍認(rèn)為，機械因素在決定動脈疾病的發(fā)生部位方面起到很重要的作用，但是影響最大的機械環(huán)境有何特點的問題尚不十分清楚?，F(xiàn)有的很多文獻只是專注于血流產(chǎn)生的WSS本身作為決定發(fā)病部位的因素，特別是與血管分叉有關(guān)的低均值WSS和反轉(zhuǎn)性振動 WSS（Reversing oscillatory WSS）。但是，經(jīng)過對青少年和低齡成年人冠狀動脈粥樣硬化的大規(guī)模研究發(fā)現(xiàn)，57%的動脈粥樣硬化病變與分叉并無任何關(guān)聯(lián)［25］。近期研究［26］表明，人類冠狀動脈的內(nèi)膜厚度與 WSS的模式并不相干。Steianman et al［27］也發(fā)現(xiàn)，頸動脈分叉處的 WSS模式與內(nèi)膜厚度之間也無關(guān)。這些研究提示，除了 WSS之外，尚有其他因素起著重要作用。值得注意的是，冠狀動脈和頸動脈分叉處的WSS和CS最不同步（圖2）。

圖2 降主動脈和冠狀動脈的血流，血壓及其SPA血流引起管壁剪應(yīng)力（Wall shear stress，WSS），而血壓形成周圍牽張力（circumferential strain，CS）。升主動脈血壓與冠狀動脈近端血壓基本相同；主動脈血流（WSS）和血壓（CS）均在收縮期達到高峰，所以升主動脈具有同步性血流動力學(xué)特點。而冠狀動脈血流（WSS）卻在舒張期達到高峰，此時血壓（CS）卻在下降之中，因而冠狀動脈具有非同步性血流動力學(xué)特點，WSS與CS二者具有相位差。一個心跳周期時相為360度，對冠狀動脈來講，血流和血壓的峰值基本上各占1／2周，SPA達到180度；而主動脈的血流峰值則基本上與血壓峰值同步，即二者沒有相位差，SPA為0度。計算方法如下：SPA＝CSWSS＝P（血壓）－Q（血流）＝45－225＝－180度。

根據(jù)冠狀動脈的彎曲特性，采用冠狀動脈的三維彈性管模型對其搏動性血流進行數(shù)字化模擬，結(jié)果提示，冠狀動脈內(nèi)側(cè)壁的WSS比外側(cè)壁要低50%，但內(nèi)側(cè)壁的 WSS振動卻較強［10］。與其他動脈血管比較，冠狀動脈的WSS與CS之間的SPA高出許多：內(nèi)側(cè)壁SPA為－250°，外側(cè)壁為－220°，顯示出非常不同相。這說明，除了WSS，SPA對于動脈粥樣硬化的發(fā)生部位也有很重要的作用。這是關(guān)于SPA的第一個證據(jù)。在此基礎(chǔ)上，Tarbell博士［15］設(shè)計出了能夠模擬體內(nèi)血流動力學(xué)特點的血流動力學(xué)模擬儀。采用該儀器，通過特殊設(shè)計的電腦軟件的控制，和與CO2培養(yǎng)箱的聯(lián)合使用，可以實時記錄 WSS和CS聯(lián)合作用于內(nèi)皮細胞時的波形改變。然后測定內(nèi)皮細胞的基因表達，結(jié)果是，與SPA為0°相比，SPA為－180°時內(nèi)皮細胞表現(xiàn)為促動脈粥樣硬化性（proatherogenic）基因表達：eNOS 和Cox-2減少，而ET-1升高；SPA為0°則為動脈保護性（athero-protective，antiatherogenic）基因表達，或者是正常動脈性（atheronormic）基因表達譜。

通過建立血管分叉處（頸總動脈進入頸內(nèi)動脈和頸外動脈處）的彈力模型，對與此有關(guān)的液體－固體相互作用的問題進行了超級計算機模擬，首次進行了復(fù)雜的CS／WSS比值的計算和分析［12］。分析表明，在頸動脈外側(cè)壁的WSS和CS之間的相位角（SPA）負(fù)值較大，此處常出現(xiàn)動脈粥樣硬化斑塊。該結(jié)果與冠狀動脈和主動脈分叉處的測定和計算結(jié)果一致，即較大的負(fù)SPA值與動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生有關(guān)［11］；同時與體外細胞學(xué)研究的結(jié)論也相符，即較大的負(fù)SPA值產(chǎn)生促動脈粥樣硬化性基因表達譜和代謝物釋放譜。給牛主動脈內(nèi)皮細胞（BAEC）以二種作用力，WSS和CS，持續(xù)5h，然后比較不同SPA對NO分泌的影響，研究顯示，SPA 0°屬于正常動脈性表型，與其相比，SPA為－180°時，表現(xiàn)為促動脈粥樣硬化性表型，即NO分泌減少；所以，提出了這樣一種假設(shè)，即SPA為較大負(fù)值（－180°）時，為促動脈粥樣硬化性作用。

最近，一項臨床研究結(jié)果再一次驗證了SPA理論的正確性。英國科學(xué)家［16］采用計算機流體動力學(xué)的方法，探討了右冠狀動脈（RCA）經(jīng)皮冠狀介入治療前后流速波形和動脈幾何學(xué)改變的影響。首先，他們根據(jù)一動脈狹窄患者的多幅計算機斷層掃描圖像，對右側(cè)冠狀動脈進行了重建。同時作為對照，對非狹窄患者的冠狀動脈也作了重建（圖3）。結(jié)果表明，冠狀介入治療前后的波形差異不影響WSS和OSI（振動應(yīng)力指數(shù)，oscillatory shear index），但是，血壓和WSS之間的SPA卻顯著不同。PCI之前的平均SPA為－63.9°（范圍為－204°至－10°），PCI后的平均SPA則為10.4°（范圍為71.1°至25.4°）。PCI手術(shù)前WSS與血壓之間的不同步性更明顯。因此他們認(rèn)為，SPA是預(yù)測動脈粥樣硬化的一個重要指標(biāo)。

圖3 血流動力學(xué)模擬儀示意圖

我們推測，在冠狀動脈處的－180°SPA可以通過抑制EC糖衣的機械感應(yīng)，造成NO生成減少，提高血管內(nèi)皮對動脈粥樣硬化的易感性；而在主動脈等處，0°SPA則能夠刺激EC糖衣的機械感應(yīng)，誘導(dǎo)NO生成增多，起到保護血管的作用（圖4）。

圖4 SPA，糖衣與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路A SPA與血流動力學(xué)的關(guān)系；B SPA與內(nèi)皮細胞的eNOS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

3 SPA與體內(nèi)動脈內(nèi)皮細胞的基因表達

表1、2總結(jié)了50種與動脈硬化的發(fā)生密切有關(guān)的基因。我們認(rèn)為，與SPA為0°相對應(yīng)的基因表達應(yīng)該呈現(xiàn)抗動脈粥樣硬化性特點，其基本表現(xiàn)為ET-1減少，而NOS和Cox-2升高［15］。在50種最常見的被證明與動脈粥樣硬化有關(guān)的基因中，27種分子屬于此類（表中顯示加號＋）；在動物的非動脈粥樣硬化好發(fā)部位（如主動脈弓外環(huán)、胸、腹主動脈等）的動脈內(nèi)皮細胞中，這27種基因的mRNA或者蛋白質(zhì)可能出現(xiàn)部分或全部升高，而另外21類基因可能會降低，這個結(jié)論有待進一步的實驗去驗證。和SPA為180°相對應(yīng)的基因表達應(yīng)該呈現(xiàn)抗動脈粥樣硬化性特點，其基本表現(xiàn)為ET-1減少，而NOS和Cox-2升高。在50種最常見的被證明與動脈粥樣硬化有關(guān)的基因中，21種分子屬于此類表中顯示為減號－）。在動物的動脈粥樣硬化好發(fā)部位（如主動脈弓內(nèi)環(huán)，冠狀動脈等）的動脈內(nèi)皮細胞中，這21種基因的mRNA或者蛋白質(zhì)可能出現(xiàn)部分或全部升高，而另外的27種基因的mRNA或者蛋白質(zhì)可能出現(xiàn)部分或全部降低，也有待進一步的實驗去驗證。根據(jù)已有的實驗結(jié)果，結(jié)合SPA的理論假設(shè)，我們認(rèn)為用血流動力學(xué)刺激儀，在體外分別給予血管內(nèi)皮細胞SPA為0°和180°的刺激，持續(xù)5h，其細胞的基因表達譜應(yīng)該類似于上述的體內(nèi)實驗結(jié)果。為驗證這些基因的表達與血流動力學(xué)的關(guān)系，很有必要總結(jié)有關(guān)的研究結(jié)果，以便找到一些血管內(nèi)皮細胞基因表達的規(guī)律，并與表1、2進行對比。

表1 動脈粥樣硬化有關(guān)基因及作用

表2 動脈粥樣硬化有關(guān)的基因作及作用

4 小結(jié)

動脈粥樣硬化的發(fā)生不僅與WSS有關(guān)，更與CS有關(guān)；不僅與CS有關(guān)，更與WSS和CS之間的相位角有關(guān)；細胞水平上，當(dāng)給予BAEC的剪切力為SPA－180°時，基因表達呈現(xiàn)動脈粥樣硬化性特點，即eNOS和Cox-2減少，而ET-1升高；而對照細胞的SPA為－0°，基因表達則呈現(xiàn)抗動脈粥樣硬化性特點，即ET-1減少，而NOS和Cox-2升高。動物實驗方面，冠狀動脈為動脈粥樣硬化好發(fā)部位，其SPA為－180°（計算機模擬結(jié)果），基因表達呈現(xiàn)動脈粥樣硬化性特點，即eNOS和Cox-2減少，而ET-1升高；主動脈為動脈粥樣硬化非好發(fā)部位，其SPA為－0°（計算機模擬結(jié)果），基因表達呈現(xiàn)抗動脈粥樣硬化性特點，即ET-1減少，而eNOS和Cox-2升高。藥物作用方面，當(dāng)給予BAEC細胞SPA為－180°的同時，加入共軛亞麻酸，則基因表達呈現(xiàn)抗動脈粥樣硬化性特點，即ET-1減少，而eNOS和Cox-2升高；其對照組僅SPA為－180°，沒有給予共軛亞麻酸，基因表達呈現(xiàn)動脈粥樣硬化性特點，即eNOS和Cox-2減少，而ET-1升高。預(yù)期SPA為－180°時，動脈內(nèi)皮細胞的基因表達呈現(xiàn)動脈硬化保護性基因的減少和易感性基因的激活，二者之間不平衡，如表1所示。而SPA為0°時，動脈內(nèi)皮細胞的基因表達則相反。

5 研究方向

預(yù)期在不同的動脈內(nèi)皮細胞內(nèi)有不同的特異基因的表達，在冠狀動脈等動脈粥樣硬化好發(fā)部位，基因表達呈現(xiàn)動脈粥樣硬化性特點；而在主動脈等動脈粥樣硬化非好發(fā)部位，其基因表達呈現(xiàn)抗動脈粥樣硬化性特點。通過比較細胞核動物水平的基因表達差異，可以篩選出動脈粥樣硬化性基因和動脈粥樣硬化保護性基因。進一步可以在細胞水平進行這些基因的沉默，研究基因的功能；如果目的基因沉默后對BAEC的eNOS等基因表達有影響，則有必要做基因敲除研究。比較某一基因敲除后，有關(guān)基因如eNOS的表達的改變和對內(nèi)皮細胞和血管功能的影響，見圖5。

致謝：感謝美國紐約城市大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系主任，杰出教授，美國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會前主席John M Tarbell教授對本項目的悉心指導(dǎo)和大力支持。

圖5 驗證SPA概念的實驗設(shè)計（信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路——另圖為圖4）

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