李賽男,李朝飛, 龐 義, 楊 凱

(1. 肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院, 中國 肇慶 526061; 2. 中山大學(xué)有害生物控制與資源利用國家重點實驗室, 中國 廣州 510275)

甜菜夜蛾核多角體病毒(Spodopteraexiguamulticapsid nucleopolyhedrovirus,SeMNPV)屬于昆蟲桿狀病毒科核多角體病毒屬．桿狀病毒是一類雙鏈DNA 病毒，是感染昆蟲和其它節(jié)肢動物的主要病原，具有高度的宿主專一性[1]．SeMNPV的宿主昆蟲甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)屬鱗翅目夜蛾科，是一種世界性分布的多食性害蟲，自20世紀90年代以來曾相繼在廣東、云南、江西、湖南、浙江、江蘇、臺灣等多種蔬菜及棉花、大豆、甜菜等經(jīng)濟作物上暴發(fā)性發(fā)生，對當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成重大損失，而且隨著廣譜殺蟲劑的大量施用和濫用，甜菜夜蛾對許多農(nóng)藥產(chǎn)生了抗性，多類化學(xué)農(nóng)藥已對其失去防治效果．研究表明，SeMNPV能有效防治甜菜夜蛾，對控制甜菜夜蛾具有潛在的發(fā)展前景，已被成功開發(fā)為生物殺蟲劑用于防治甜菜夜蛾[2-3]．但是昆蟲病毒種間的遺傳變異較大，宿主專一性強，殺蟲速度緩慢，故限制了它們的應(yīng)用[4]．為此，深入研究SeMNPV分子生物學(xué)，構(gòu)建高殺蟲毒力的重組病毒殺蟲劑，具有重要的理論意義和廣闊的應(yīng)用前景．

自苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒(Autographacalifornicamultiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV) 的全基因組序列被測定以來[5]，至今已有50株桿狀病毒的全基因組序列被測定．其中，46株病毒的宿主是鱗翅目昆蟲，膜翅目昆蟲病毒3株，1株雙翅目昆蟲病毒[6]．BLAST搜索并Clustal W比對發(fā)現(xiàn)，Se29所編碼的氨基酸序列與SpodopterafrugiperdaNPV ORF28、AgrotissegetumNPV ORF30、SpodopteralituraMNPV ORF119、HelicoverpaarmigeraSNPV ORF128、AcMNPV ORF17和BombyxmoriNPV ORF9所編碼的氨基酸序列一致性分別為46%、43%、27%、25%、10%和9%．有研究表明，BombyxmoriNPV ORF9(Bm9) 是一個早期基因，在病毒感染后3 h開始轉(zhuǎn)錄，表達產(chǎn)物存在于被感染細胞的細胞質(zhì)中，AcMNPV ORF17(Ac17) 是晚期基因，其表達產(chǎn)物存在于被感染細胞的細胞質(zhì)和細胞核中，Bm9和Ac17的缺失均不影響病毒DNA的復(fù)制，但是降低了芽生型病毒粒子(Budded virus, BV)的生產(chǎn)水平[7-8]．HelicoverpaarmigeraSNPV ORF128(Ha128)基因是一個晚期表達基因，其表達產(chǎn)物HA128位于被感染細胞的細胞質(zhì)中，與宿主蛋白發(fā)生相互作用，可能在病毒的侵染過程中發(fā)揮作用[9]．SE29與HA128同源性較高，其是否具有與HA128相同功能以及其在病毒侵染過程中的作用值得關(guān)注．到目前為止，有關(guān)Se29及其其它同源基因的分子生物學(xué)特性和功能的研究尚未見報道．本文為了深入研究Se29基因的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，在大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)BL21( DE3)中表達了SE29蛋白，電泳純化后免疫家兔，制備了多克隆抗體，為進一步研究SE29蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)．

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 甜菜夜蛾核多角體病毒毒株SeMNPV-SeUS1由美國California University, Riverside分校的Dr. Federici B A惠贈；E.coli菌株BL21 (DE3 )由中山大學(xué)有害生物控制與資源利用國家重點實驗室保存；克隆載體pMD18-T 購自TaKaRa公司；表達載體pET-28a(+) 購自Novagen公司；甜菜夜蛾細胞系Se301由日本的Dr. Kawarabata惠贈，細胞維持于添加了體積分數(shù)為10%的胎牛血清(全文同)的Grace’s 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為28 ℃．

1.1.2 主要試劑 質(zhì)粒提取試劑盒和DNA回收試劑盒購自O(shè)mega公司； 6×His-tag表達試劑盒(QIA expressionistTM)購自Qiagen公司；Taq酶購自上海生物工程公司；限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司；T4DNA連接酶、丙烯酰胺和N，N′-亞甲雙丙烯酰胺為Promega產(chǎn)品；DNA相對分子質(zhì)量、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、IPTG和X-gal等試劑均為東盛生物工程公司產(chǎn)品；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購自Gibco BRL公司；其它試劑為國產(chǎn)分析純．

1.1.3 儀器 PCR 擴增儀、凝膠成像系統(tǒng)、聚丙烯酰胺凝膠電泳與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印系統(tǒng)裝置購自美國Bio-Rad 公司，臺式高速冷凍離心機為德國Eppendorf公司產(chǎn)品．

1.1.4 培養(yǎng)基 采用常規(guī)固體或液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌，昆蟲細胞培養(yǎng)基為添加了10%胎牛血清的Grace’s 培養(yǎng)基．

1.2 方法

1.2.1SeMNPV基因組DNA的提取SeMNPV基因組DNA的提取參照文獻[10]的方法進行．

1.2.2 引物設(shè)計及PCR 根據(jù)SeMNPV 基因組全序列[11](Genbank accession No. NC_002169)，運用DNASTAR軟件設(shè)計一對擴增Se29基因全長的引物，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成．上游引物Se29-P1：5′-GGATCCATGTTTGAATTCGATAAAGATTTTA-3′(下劃線部分為引入的BamHⅠ酶切位點)；下游引物Se29-P2：5′-AAGCTTTTACATTTTACCTACACCATAAC-3′(下劃線部分引入的HindⅢ酶切位點)．PCR反應(yīng)體系為50 μL，模板為SeMNPV基因組DNA．PCR反應(yīng)設(shè)計為：94 ℃預(yù)變性，3 min，1次；94 ℃變性，1 min，50 ℃退火，1 min，72 ℃延伸，1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min后移至4 ℃存放．?dāng)U增完畢后，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并對Se29基因的PCR產(chǎn)物進行回收．

1.2.3Se29基因原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建 原核表達重組載體的構(gòu)建策略如圖1所示．DNA回收和質(zhì)粒提取按照試劑盒操作說明進行．酶切、連接、轉(zhuǎn)化等步驟均按文獻[12]進行．重組表達質(zhì)粒pET-Se29經(jīng)過酶切鑒定后，在上海英駿生物技術(shù)有限公司對插入的DNA片段測序，鑒定插入片段的正確性．

1.2.4Se29基因在E.coli中的表達 將經(jīng)測序鑒定后的重組質(zhì)粒pET-Se29轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，挑取含pET-Se29的單克隆接種于3 mL LB 培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)后，次日以1%轉(zhuǎn)接，37 ℃振搖至OD600=0.5，加入IPTG至終濃度1 mmol/L，37 ℃誘導(dǎo)5 h，收集菌體進行12%(體積分數(shù))聚丙烯酰胺凝膠電泳分析和Western印跡分析，方法參照QIA expressionistTM說明書進行．

1.2.5 抗體的制備 參照文獻[12]的方法，表達產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，按文獻[13] 的方法制備抗體．從15～ 20 塊SDS-PAGE膠上割取所需要的目的帶，研磨成勻漿反復(fù)通過7號注射針頭，純化的融合蛋白與等體積的弗氏佐劑乳化后免疫新西蘭大白兔，制備多克隆抗體．

1.2.6 抗體的檢測 取SeMNPV感染72 h后的Se301細胞，用SE29多克隆抗體按Western免疫印跡試劑盒(Roche Molecular Biochemicals)說明進行Western blot分析．抗體以1∶1 000用1×封閉液稀釋．

2 結(jié)果

2.1 原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建

M：DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：PCR產(chǎn)物；2：重組質(zhì)粒T-Se29的BamHⅠ/HindⅢ雙酶切；3：重組質(zhì)粒pET-Se29的BamHⅠ/HindⅢ雙酶切圖2 PCR產(chǎn)物、重組質(zhì)粒T-Se29和pET-Se29的鑒定

用引物Se29-P1和Se29-P2從SeMNPV基因組中擴增了Se29基因，擴增片段共642 bp，與預(yù)期大小相符(圖2，泳道1)．回收PCR產(chǎn)物，連入pMD18-T克隆載體，得到質(zhì)粒T-Se29，進行BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，獲得與預(yù)期大小一致的642 bp的目的片段和2.692 kb的載體片段(圖2，泳道2)．以BamHⅠ和HindⅢ酶切T-Se29，回收Se29基因片段，連接到同樣雙酶切的pET-28a(+)上，得到質(zhì)粒pET-Se29，用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，獲得與預(yù)期大小一致的642 bp的目的片段和5.369 kb的載體片段(圖2，泳道3)．測序結(jié)果表明，插入片段與NCBI上公布的該片段序列完全一致，而且Se29基因與載體pET-28a(+)連接正確．

2.2 Se29在E.coli中的表達

將重組表達質(zhì)粒pET-Se29轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)，以IPTG誘導(dǎo)5 h，離心收集細胞，進行SDS-PAGE．結(jié)果表明，產(chǎn)生了大小約為27 000 的特異性蛋白條帶，Se29基因編碼213個氨基酸，翻譯產(chǎn)物理論相對分子質(zhì)量為24 400，本實驗所表達蛋白的大小比預(yù)期大小略大；而經(jīng)誘導(dǎo)的E.coliBL21(DE3)和未經(jīng)誘導(dǎo)的含重組表達質(zhì)粒pET-Se29的E.coliBL21(DE3)在相應(yīng)的位置上沒有出現(xiàn)誘導(dǎo)的蛋白帶( 圖3 )．以Ni-NTA堿性磷酸酶偶聯(lián)抗體進行Western blot分析，在硝酸纖維膜上檢測到相對分子質(zhì)量約為27 000的蛋白條帶，而同時轉(zhuǎn)印的對照樣品則檢測不到任何蛋白條帶(圖4)，表明誘導(dǎo)的目的蛋白成功地進行了融合表達，并在N-端攜帶有6×His接頭．

M：蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的BL21(DE3)；2：未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的BL21(DE3)/pET-Se29；3：經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的BL21(DE3)/pET-Se29圖3 SE29蛋白在E.coli BL21(DE3)中的表達的SDS-PAGE

M：預(yù)染蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的BL21(DE3)；2：未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的BL21(DE3)/pET-Se29；3：經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的BL21(DE3)/pET-Se29圖4 用Ni-NTA conjugate 抗體檢測SE29蛋白在E.coli BL21(DE3)中的表達的Western blot分析

2.3 Se29抗體的制備與檢測

M：預(yù)染蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1：未感染病毒的Se301細胞; 2：SeMNPV 感染后的Se301細胞圖5 SE29蛋白抗體在病毒感染的細胞中的檢測

將從SDS-PAGE膠上割取的融合蛋白免疫新西蘭大白兔，3次加強免疫后收取抗血清．制備的SE29抗血清能在SeMNPV 感染72 h的Se301細胞總蛋白中雜交到一條約24 400的特異雜交帶，而未感染病毒的對照細胞中沒有陽性信號( 圖5 )．表明制備的抗體特異性較好，適合用作以后有關(guān)Se29功能的研究．

3 討論

SeMNPVSe29的同源基因廣泛存在于已經(jīng)測定全基因組序列的鱗翅目桿狀病毒( NPV) 基因組中．Se29的同源基因Ac17和Bm9的缺失均不會影響病毒DNA的復(fù)制，但是降低了BV的產(chǎn)生水平[7-8]．Ha128基因的表達產(chǎn)物HA128與宿主蛋白發(fā)生相互作用，可能在病毒的侵染過程中發(fā)揮作用[9]．SE29與AC17和BM9的同源性較低，與HA128的同源性較高，其是否具有與HA128相同功能以及其在病毒侵染過程中的作用值得關(guān)注．

本論文通過PCR 的方法從SeMNPV 基因組中擴增得到Se29基因，構(gòu)建了Se29基因的原核表達質(zhì)粒，在大腸桿菌中實現(xiàn)了SE29蛋白的融合表達，跟預(yù)期大小相比蛋白稍微變大．由于原核表達載體pET-28a(+)的N 端攜帶有6×His Tag 序列，表達的蛋白在其N-端均帶有融合的6×His接頭，這可能是蛋白稍微變大的原因．用表達的融合蛋白免疫新西蘭大白兔，制備了SE29蛋白的多克隆抗體．Western blot分析表明，SE29蛋白的多克隆抗體與SeMNPV感染的Se301 細胞總蛋白顯示一條相對分子質(zhì)量約24 400的特異雜交帶，與推測的大小一致，而對照細胞中沒有出現(xiàn)相應(yīng)的帶，表明所制備的抗體是成功的．這是因為在病毒感染的真核細胞中，蛋白沒有6×His 接頭，在原核細胞中表達后的可能的結(jié)合或修飾被去除，顯示了蛋白自身的預(yù)測大小．該抗體的制備為進一步研究SE29 蛋白在病毒結(jié)構(gòu)和感染細胞中的定位、相互作用蛋白的鑒定以及Se29基因在病毒侵染過程中的可能作用奠定了基礎(chǔ)．

參考文獻：

[1] 李玲玲, 李朝飛, 龐 義. 甜菜夜蛾核多角體病毒(SeMNPV) ORF100和ORF101基因的克隆、表達與純化[J]. 生物技術(shù), 2007, 17(5): 21-24.

[2] SMITS P H, VRIE V D, VLAK J M. Nuclear polyhedrosis virus for control ofSpodopteraexigualarvae on glasshouse crops[J]. Entomol Exp Appl,1987, 43(1): 73-80.

[3] 李廣宏, 陳其津, 龐 義. 甜菜夜蛾核多角體病毒的研究與應(yīng)用進展[J]. 中國生物防治,1999, 15(4): 178-182.

[4] WU J G, MILLER L K. Sequence, transcription and translation of a late gene of theAutographacalifornicanuclear polyhedrosis virus encoding a 34.8 K polypeptide[J]. J Gen Virol,1989, 70(9): 2449-2459.

[5] AYRES M D, HOWARD S C, KUZIO J,etal. The complete DNA sequence ofAutographacalifornicanuclear polyhedrosis virus[J]. Virology,1994, 202(2): 586-605.

[6] HISCOCK D, UPTON C. Viral genome database: storing and analyzing genes and proteins from complete viral genomes[J]. Bioinformatics,2000, 16(5): 484-485.

[7] YANG Z N, XU H J, THIEM S M,etal.Bombyxmorinucleopolyhedrovirus ORF9 is a gene involved in the budded virus production and infectivity[J]. J Gen Virol,2009, 90(1): 162-169.

[8] NIE Y C, THEILMANN D A. Deletion of AcMNPV AC16 and AC17 results in delayed viral gene expression in budded virus infected cells but not transfected cells[J]. Virology,2010, 404(2): 168-179.

[9] AN S H, WANG D, ZHANG N Y,etal. Characterization of a late expression gene, Open reading frame 128 ofHelicoverpaarmigerasingle nucleocapsid nucleopolyhedrovirus[J]. Arch Virol, 2005, 150(12): 2453-2466.

[10] O’REILLY D R, MILLER L K, LUCKOW V A. Baculovirus expression vectors-A laboratory manual[M]. New York: W H Freeman and Company, 1992.

[11] IJKEL W F, STRIEN E A, HELDENS J G M,etal. Sequence and organization of theSpodopteraexiguamulticapsid nucleopolyhedrovirus genome[J]. J Gen Virol,1999, 80(12): 3289-3304.

[12] SAMBROOK J, FRITSCH E F, MANIATIS T. Molecular cloning: a laboratory manual[M]. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

[13] YIN C, YU J, WANG L,etal. Identification of a novel protein associated with envelope of occlusion-derived virus inSpodopteralituramulticapsid nucleopolyhe-drovirus[J]. Virus Genes, 2003, 26(1): 5-13.