龔 琳，王躍群，袁婺洲，莫小陽，萬永奇，江志鋼，吳秀山，李永青

(湖南師范大學蛋白質(zhì)化學與發(fā)育生物學教育部重點實驗室，心臟發(fā)育研究中心，中國 長沙 410081)

已有研究表明：堿性螺旋-環(huán)-螺旋蛋白(basic helix-loop-helix，bHLH)是真核生物中的一種特殊的轉(zhuǎn)錄因子，它們在神經(jīng)發(fā)生、肌細胞發(fā)生、心臟發(fā)育和血細胞發(fā)生、癌癥發(fā)生過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[1]．nulp1蛋白包含一個bHLH和一個功能未知命名為DUF654的結(jié)構(gòu)域[2]．在小鼠等物種中均發(fā)現(xiàn)了它的同源蛋白,并且它們之間具有極高的保守度，說明此蛋白所在的亞家族可能具有相當重要的功能．在小鼠胚胎中發(fā)現(xiàn)該基因在腎臟，神經(jīng)系統(tǒng)，和心臟中表達強烈，而在肝臟和皮膚中表達較弱[3]．作者所在研究室前期研究表明，hnulp1在人類成體心臟發(fā)育晚期表達強烈，該蛋白作為一個轉(zhuǎn)錄抑制子在細胞系中對SRF信號途徑起著極強的抑制作用，并且該抑制作用由DUF654結(jié)構(gòu)域來實現(xiàn)[4]．但是目前人們對nulp1基因的功能了解得還很有限，需要利用果蠅等多種模式生物進行深入研究．本文克隆了果蠅nulp1基因(f-nulp1)的部分編碼區(qū)，并構(gòu)建了原核表達載體，通過IPTG誘導表達，并大量純化蛋白，制備效價較高、特異性較好的多克隆抗體．對進一步研究利用果蠅研究nulp1基因生物學功能奠定基礎．

1 材料與方法

1.1 主要試劑

大腸桿菌E.coliDH5α,E.coliRosstta，本實驗室保種；載體Pet28a為本實驗室提供；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ，TagDNA聚合酶，10×loading buffer購買自深圳精美公司；RNase購買自sangon公司；pMD18-T載體和連接酶購自大連寶生物公司；柱式DNA膠回收試劑盒(離心柱型)購買自博大泰克公司；蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)、Ni親和層析柱等購自上海生工公司；弗氏佐劑購自Sigma公司； Glutathione SepharoseTM4B購自Amersham Biotech 公司；新西蘭大白兔購自中南大學湘雅醫(yī)院．

1.2 果蠅nulp1基因生物信息學分析

在flybase 數(shù)據(jù)庫(http://flybase.org/)中查找到nulp1基因在果蠅中的同源基因CG7927基因，在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上分析該基因在染色體中的位置、外顯子與內(nèi)含子數(shù)目、基因全長和開發(fā)閱讀框的堿基數(shù)目，及其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)目．利用Expasy(http://www.expasy.ch/tools/protscale.html)對果蠅nulp1進行蛋白疏水性分析．Primer Premier 5.0軟件用于酶切位點的分析和PCR引物設計．

1.3 引物設計及合成

根據(jù)nulp1基因的序列選擇親水性、抗原性比較好的區(qū)域設計引物，Sense：5′-GGAATTCATGTCTGCGCGAATGCT-3′(下劃線為EcoRⅠ酶切位點) Antisense：5′-CAGTCGACGTGGCAGTAGTCCCG-3′ (下劃線為SalⅠ酶切位點) 由上海生物公司合成．

1.4 模板的制備

模板nulp1-pOT2質(zhì)粒購買自FLYBASE．

1.5 f-nulp1基因部分編碼區(qū)的克隆

以購買的nulp1-pOT2質(zhì)粒為模板，利用f-nulp1 sense和antisense引物進行PCR擴增．反應條件為：94 ℃變性5 min;94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,反應30個循環(huán)，72 ℃延伸8 min．所得PCR產(chǎn)物為450 bp的片段，經(jīng)純化與pMD18-T載體連接,構(gòu)建質(zhì)粒pMD18-T/f-nulp1，委托上海生物公司測序．

1.6 重組表達載體的構(gòu)建

分別用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切pMD18-T/f-nulp1質(zhì)粒和表達載體pET28a，切下的目的片段與載體回收純化后連接,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，提取質(zhì)粒并進行雙酶切鑒定,篩選出陽性克隆,獲得重組質(zhì)粒pET28a/f-nulp1．

1.7 f-nulp1融合蛋白表達純化

將序列正確的重組子轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliRosetta, 37 ℃恒溫培養(yǎng)過夜．挑選轉(zhuǎn)化子．于37 ℃，220 r/min培養(yǎng)12 h．菌液以5～10 ml接種量轉(zhuǎn)接于200 mL含有卡那霉素及氯霉素雙抗的LB培養(yǎng)基，生長至OD600=0.6左右時，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，37 ℃誘導表達5 h．超聲后在上清表達，經(jīng)Ni2+親和柱純化．免疫新西蘭大白兔獲取多克隆抗體. 將純化得到的His-nulp1目的蛋白0.6 mg，按體積比1∶1與弗氏完全佐劑混合，皮下多點注射免疫新西蘭大白兔．在第14天、第21天再將目的蛋白0.15 mg與弗氏不完全佐劑混合并免疫．在第28天經(jīng)主動脈取血，收集血清，即得到果蠅nulp1蛋白的多克隆抗體．分裝后，加入疊氮化鈉-80 ℃保存．

1.8 Western blotting分析抗體特異性

將含pET28a/f-nulp1重組子的BL21菌株在LB培養(yǎng)液中37 ℃培養(yǎng)，按1∶50比例接種于200 mL新鮮培養(yǎng)基中，用IPTG在37 ℃條件下誘導5 h后，收集細菌，PBS重懸，SDS-PAGE電泳分離．將nulp1抗體稀釋2 000倍后，以His抗體作為對照，采用Western blotting方法檢測抗體的特異性．

1.9 nulp1蛋白在果蠅胚胎時期的表達分析

分別提取0～0.5 h，1～1.5 h，2～2.5 h，3～3.5 h，4～4.5 h，5～5.5 h，6～6.5 h，7～7.5 h，8～8.5 h，9～9.5 h，10～10.5 h，11～11.5 h，12～12.5 h，13～13.5 h，14～14.5 h，15～15.5 h，16～16.5 h，17～17.5 h共18個時期的果蠅胚胎的總蛋白，進行SDS-PAGE電泳分離．將nulp1抗體稀釋2000倍后，采用Western blot方法對表達的總蛋白抗原雜交．同等條件下，用tubin抗體進行Western blot分析作為對照．

2 結(jié)果

2.1 果蠅nulp1片段的獲得及重組質(zhì)粒的構(gòu)建

果蠅nulp1(登錄號為NM_139917.2)位于果蠅3號染色體上，mRNA長度為2 500 bp，含7個外顯子，6個內(nèi)含子．利用Expasy(http://www.expasy.ch/tools/protscale.html)對果蠅nulp1進行蛋白疏水性分析，選擇克隆親水性較高的148個氨基酸即從N端第一個氨基酸開始到第148個氨基酸序列(蛋白登錄號：NP_648174)．

經(jīng)PCR技術(shù)擴增出果蠅的nulp1基因片段后，純化回收目的片段，然后與pMD18-T連接．用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切pMD18-T-nulp1質(zhì)粒，產(chǎn)生與nulp1所需片段大小一致的酶切片段，約450 bp(圖1)．表明該片段已插入到pMD18-T載體中．測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫報道一致．將目的片段插入經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切的pET28a載體．EcoRⅠ/SalⅠ酶切驗證(圖2)及測序分析的結(jié)果都表明pET28a/f-nulp1構(gòu)建成功(圖3).

M: SM0331 DNA 相對分子質(zhì)量標準； M: SM0331 DNA 相對分子質(zhì)量標準； 1：EcoRⅠ/SalⅠ雙酶切結(jié)果 1：EcoRⅠ/SalⅠ雙酶切結(jié)果圖1 pMD18-T/f-nulp1質(zhì)粒酶切鑒定圖譜 圖2 pET28a/f-nulp1重組表達質(zhì)粒雙酶切鑒定圖譜圖3 pET28a/f-nulp1質(zhì)粒示意圖

2.2 His-nulp1融合蛋白誘導表達和純化

將重組子轉(zhuǎn)入Rosetta大腸桿菌中，以0.5 mmol/L IPTG 37 ℃度誘導，經(jīng)4 h取樣進行SDS-PAGE 電泳分析．結(jié)果表明，經(jīng)IPTG誘導后大量表達出相對分子質(zhì)量約為26 000的融合蛋白(圖4)，與預期結(jié)果一致．

該蛋白經(jīng)Ni-His親和純化后，SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍染后，顯示出特異性較強的條帶(圖5)．

2.3 nulp1多克隆抗體特異性檢測

將pET28a-f-nulp1轉(zhuǎn)化Rosetta菌株誘導表達的總蛋白進行Western blot檢測，免疫后的兔血清稀釋成不同的濃度梯度，以免疫前的兔血清作為陰性對照．結(jié)果顯示陰性對照未見條帶,而免疫后血清在His-f-nulp1所在位置有一條特異的帶出現(xiàn)(圖6),說明產(chǎn)生的兔抗His-f-nulp1血清是f-nulp1的特異性抗體．

M：SM0671 蛋白相對分子質(zhì)量標準；1：未經(jīng)誘導的pET28a/f-nulp1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的Rosetta總蛋白；2：IPTG誘導4 h后的pET28a/f-nulp1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的Rosetta總蛋白；3：IPTG誘導5 h后的pET28a/f-nulp1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的Rosetta總蛋白圖4 SDS-PAGE 電泳圖譜

M：SM0671 蛋白相對分子質(zhì)量標準；1：未經(jīng)誘導的pET28a/f-nulp1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的Rosetta總蛋白；2：IPTG誘導的 pET28a/f-nulp1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的Rosetta總蛋白；3：經(jīng)過Ni-His親和純化后的剩下的樣品； 4：經(jīng)過第1次 1 mL Elution buffer 洗脫后的蛋白； 5:經(jīng)過第2次 1 mL Elution buffer 洗脫后的蛋白； 6：經(jīng)過第3次 1 mL Elution buffer 洗脫后的蛋白圖5 SDS-PAGE 電泳圖譜

圖6 Western blotting檢測抗體的特異性

2.4 nulp1蛋白在果蠅胚胎各個時期的表達分析

利用f-nulp1多克隆抗體對果蠅胚胎各個時期蛋白進行Western blot分析．并在相同情況下，以Tubin抗體進行Western blot分析作為對照．結(jié)果表明果蠅胚胎中nulp1蛋白在3 h之后的表達量較2～2.5 h有所增強，之后趨于穩(wěn)定表達，但在17 h時nulp1蛋白的表達量明顯下降(圖7)．

圖7 Western blot檢測nulp1 蛋白在果蠅胚胎各個時期的表達

3 討論

nulp1蛋白是一個含有堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，在細胞中做為一個轉(zhuǎn)錄抑制子對SRF信號途徑起著極強的抑制作用[5]．因此利用果蠅這種重要的模式生物研究該基因調(diào)控心臟發(fā)育的詳細分子機制具有重要意義． 本研究的目的是制備高效價和特異性好的兔抗-f-nulp1的多克隆抗體．果蠅nulp1基因mRNA有2 500 bp，因此在制備抗體時需要選擇其中親水編碼區(qū)進行克?。?/p>

多肽抗體制備中，抗原表位的設計是十分重要的．氨基酸序列的親水性、表露性等決定了多肽的抗原性[6]．利用Expasy(http://www.expasy.ch/tools/protscale.html)在線分析軟件分析計算出果蠅nulp1蛋白的疏水性圖譜，選擇克隆其中編碼一段親水性較高的、約450 bp的序列．

pET系統(tǒng)是在E.coli中克隆表達重組蛋白的功能最強大的系統(tǒng)．充分誘導時，幾乎所有的細胞資源都用于表達目的蛋白；誘導表達后僅幾個小時，目的蛋白通?？梢哉嫉郊毎偟鞍椎?0%以上[7]．本研究中使用的是pET28a載體，而選擇的用于表達的宿主菌為Rosetta(DE3)．Rosetta(DE3)宿主菌是BL21衍生菌，能明顯增強帶有大腸桿菌稀有密碼子的真核蛋白的表達．該菌株通過一個相容性氯霉素抗性質(zhì)粒補充密碼子AUA、AGG、AGA、CUA、CCC和GGA的tRNAs．這樣Rosetta菌株實現(xiàn)了“萬能”的翻譯．而一般情況下，由于受大腸桿菌密碼子使用頻率的限制，真核蛋白表達常有困難．在以Rosetta(DE3)為宿主菌轉(zhuǎn)入pET28a-nulp1質(zhì)粒表達出的蛋白是帶有由6個連續(xù)的組氨酸組成的His標簽，可通過Ni2+金屬螯合層析進行純化[8]．

在本研究中，作者構(gòu)建pET28a-nulp1質(zhì)粒，獲得了高純度的蛋白并且制備了大量果蠅nulp1多克隆抗體，用Western blot測定血清的效價，抗血清在稀釋度為1∶2 000和1∶3 000時，抗體的特異性和敏感性都比較好．在利用f-nulp1多克隆抗體對果蠅胚胎各個時期蛋白進行Western blot分析中發(fā)現(xiàn)：果蠅胚胎nulp1蛋白的表達在2.5 h之后表達開始增強．但是在17 h時nulp1蛋白表達有明顯下調(diào),由于nulp1蛋白可能與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育以及心臟發(fā)育有關(guān)，而17 h時的胚胎的神經(jīng)系統(tǒng)以及心臟仍處于發(fā)育中，所以初步推測可能是nulp1蛋白的一個暫時性表達量下調(diào)．對于nulp1蛋白的這一表達下調(diào)及其生物學意義還有待進一步的研究．本文所制備的果蠅nulp1多克隆抗體，為將來運用免疫共沉淀、染色質(zhì)免疫沉淀、胚胎抗體染色等手段深入研究nulp1基因的功能奠定了基礎．

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