熊格生，劉 志，吳莎莎，盧向陽，劉如石

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)a.科學(xué)技術(shù)師范學(xué)院，b.生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，中國 長沙 410128；2.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，中國 長沙 410081)

隨著我國經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，能源缺口不斷擴(kuò)大[1]，開發(fā)可再生的生物能源成為我國能源發(fā)展的大趨勢[2]．但是發(fā)展生物能源的關(guān)鍵是高效優(yōu)質(zhì)的纖維素酶的獲得．

自從 1906 年在蝸牛消化道發(fā)現(xiàn)纖維素酶以來,纖維素的微生物降解問題就得到了國內(nèi)外學(xué)者的很大關(guān)注[3-5]．國外對纖維素酶的研究有近 40 年的歷史, 里氏木酶是公認(rèn)產(chǎn)纖維素酶最高的菌種之一[6]．我國從上世紀(jì) 70 年代開始通過篩選、誘導(dǎo)突變、基因工程技術(shù)成功培育出眾多的優(yōu)良菌株, 如綠色木霉、康氏木霉, 黑曲霉等,在食品、釀造、紡織、洗滌、畜牧、造紙、環(huán)保、制藥等方面均有廣泛的應(yīng)用[7-8]．

本研究用剛果紅羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基法結(jié)合傳統(tǒng)的酶活性方法，從來自長白山原始森林的腐爛枯木、落葉泥土和常年堆積木頭的腐質(zhì)土中分離篩選到一株高效的纖維素分解菌，然后將篩選的優(yōu)質(zhì)菌株進(jìn)行分類，并進(jìn)行酶活評估和稻草發(fā)酵試驗(yàn)，為今后農(nóng)作物廢棄物的綜合利用和生物質(zhì)能的發(fā)展提供可靠的實(shí)驗(yàn)參考．

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 采自長白山原始森林的腐爛枯木、落葉泥土和常年堆積木頭的腐質(zhì)土．

1.1.2 主要試劑和儀器 DNS試劑 (二硝基水楊酸試劑)、檸檬酸緩沖液、乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液，羧甲基纖維素(購自上海生工)，新華定性濾紙(型號102,杭州新華紙業(yè)有限公司)，0.125 mm孔徑稻草粉的制備：將稻草秸稈切成 2～3 cm小片段，烘干后粉碎至0.125 mm孔徑，不經(jīng)過其他步驟處理，纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40.2%．

1.1.3 培養(yǎng)基 (1)纖維素分解菌富集培養(yǎng)基：CMC-Na 5 g, NaNO31 g, Na2HPO4·12H2O 1.6 g,KH2PO40.9 g, KCl 0.5 g, MgSO4·7H2O 0.5 g,酵母浸膏 0.5 g, 蛋白胨 0.5 g, ddH2O 1 000 mL；(2)羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基[9-10]；(3)濾紙崩解實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：蛋白胨 0.1 g,酵母浸膏1.0 g, (NH4)2SO40.4 g, K2HPO40.2 g, MgSO4·7H2O 0.01 g，1.0 g 滅菌濾紙條2條，ddH2O 100 mL；(4)濾紙篩選觀察培養(yǎng)基：蛋白胨0.5 g，酵母浸膏0.05 g, NaCl 0.5 g,CaCO30.2 g，1.0 g 滅菌濾紙條2條，ddH2O 100 mL；(5)稻草產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：0.125 mm孔徑稻草粉 1.5 g, NH4NO30.1 g,KH2PO40.1 g, MgSO4·7H2O 0.05 g, ddH2O 100 mL；(6)液體產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：CMC-Na 1.5 g，NH4NO30.1 g,KH2PO40.1 g,MgSO4·7H2O 0.05 g, ddH2O 100 mL．

1.2 方法

1.2.1 菌種的富集與分離 用無菌方法分別稱取長白山原始森林腐爛枯木、落葉泥土和常年堆積木頭的腐質(zhì)土等各 5 g 分別置于 200 mL帶玻璃珠的裝富集培養(yǎng)基中的錐形瓶中，29 ℃，200 r/min，振蕩培養(yǎng) 4 d．將樣品的富集培養(yǎng)基上清進(jìn)行稀釋，取3個梯度10-4、10-5、10-6涂板于羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基平板(終濃度為8 mg/L)，29 ℃于恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5 d 左右，根據(jù)水解圈直徑與菌落直徑的比值大小和水解圈清晰程度確定初篩菌株．然后將初篩的菌株劃線分離，得到純培養(yǎng)．

1.2.2 菌種菌落形態(tài)及生理生化特性測定 觀察菌落和菌種形態(tài)特征(采用水浸片法和平板插片法觀察法)，并參照《真菌鑒定手冊》和中國真菌志(第35卷)進(jìn)行菌種鑒定．

1.2.3 菌株18S rDNA序列鑒定 總DNA的提?。悍Q取100 mg 濕菌(濾紙吸干水分)，加入2.7 mL DNA提取緩沖液(100 mmol/L Tris·HCl，100 mmol/L EDTA-Na2，100 mmol/L 磷酸鹽，1.5 mol/L NaCl，1% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))CTAB，pH 8.0)和33 μL蛋白酶K(10 g/L)，混勻后37 ℃ 反應(yīng)0.5 h；再加入0.3 mL 20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) SDS，65 ℃ 反應(yīng)2 h；4 ℃，6 000×g離心20 min，收集上清；沉淀用上述方法重復(fù)抽提2次，將上清合并，加入與上清等體積的酚、氯仿、異戊醇混合液(v酚∶v氯仿∶v異戊醇=25∶24∶1)純化DNA，然后用0.6倍體積的異丙醇沉淀，70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇洗滌后將DNA重懸于200 μL TE緩沖液中．

18S rDNA PCR擴(kuò)增：采用ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)引物擴(kuò)增菌株的18S rDNA．PCR反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 40 s，58 ℃ 50 s，72 ℃ 30 s，30 cycle；72 ℃ 10 min．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，用NCBI網(wǎng)Blast 程序?qū)?shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比較分析，然后用MEGA4.1的最大簡約法(Maxiumum Parsimong)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建．

1.2.4 菌種的濾紙降解能力測定 濾紙崩解能力測定：接種200 μL 菌液于以濾紙條為唯一碳源的 50 mL 濾紙崩解實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基中,在29 ℃ 和 120 r/min的條件下,振蕩培養(yǎng) 24 h，觀察濾紙條崩解潰爛情況．

失重法測定纖維素分解活性：接種 5mL 菌液于 100 mL以濾紙為唯一碳源的濾紙篩選觀察培養(yǎng)基濾紙(每組設(shè)3個重復(fù)), 29 ℃靜止培養(yǎng) 6 d 后，7 000×g 離心，倒上清液，用鹽酸和硝酸的混合液沖洗而消除菌體，離心，清水洗，離心，105 ℃ 烘干后稱重，計算失重率．

1.2.5 纖維素酶活力測定[11]纖維素粗酶液的制備：用無菌生理鹽水適當(dāng)調(diào)節(jié)孢子懸液濃度,血細(xì)胞計數(shù)為4.8×107個/mL,然后接種1 mL孢子懸液于50 mL液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基,29 ℃ 220 r/min 條件下培養(yǎng)．培養(yǎng)液經(jīng)12 000×g 離心 10 min,取上清液作為粗酶液測定酶活．

羧甲基纖維素酶(CMCase)活力測定：取適當(dāng)稀釋的粗酶液0.5 mL，加入到含有 1.5 mL CMC-Na檸檬酸緩沖液(pH 4.8)的血糖管中，50 ℃水浴 30 min，采用DNS法測定糖濃度的方法測定粗酶液水解CMC-Na生成葡萄糖的量來確定其酶活性．定義每分鐘1 L催化底物水解生成 1 μg 葡萄糖所需的酶量為16.67 nkat．

全酶活-濾紙酶(FPase) 活力測定：將適當(dāng)稀釋的酶液0.5 mL，加入到50 mg折成M型的雙圈濾紙和1.5 mL 0.05 mol/L pH 4.8檸檬酸緩沖液的血糖管中,輕輕搖勻,使濾紙完全浸泡在液體中,50 ℃保溫 1 h，立刻按 DNS法測定糖濃度，酶活性單位定義同上．

2 結(jié)果與分析

圖1 分離菌株純培養(yǎng)在剛果紅羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)平板上產(chǎn)生的水解圈

2.1 菌種篩選分離

將采樣上清涂布于剛果紅羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基初篩平板上培養(yǎng) 5 d 后，發(fā)現(xiàn)有許多菌落周圍產(chǎn)生了不同大小的水解透明圈，從形態(tài)上看有細(xì)菌、放線菌和真菌，其中細(xì)菌和放線菌的透明圈模糊，比值很?。婢乃馊ο鄬^大而且清晰，其中3株絲狀真菌透明圈清晰而且水解直徑和菌落比值較大，確定其為產(chǎn)纖維素菌株，將篩選到的該菌株再以劃線分離純化，然后保存?zhèn)溆茫渲型该魅ψ钋逦该鞯囊恢暝趧偣t羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上形成的菌落和水解圈見圖1，初步表明初篩菌株具有較好的纖維素分解能力，命名為 CBS-1．

2.2 菌株的酶活性研究

圖2 菌株培養(yǎng)24 h 的濾紙降解情況

2.2.1 濾紙崩解能力與失重率的計算 將初篩的3株產(chǎn)纖維素酶的菌株進(jìn)行濾紙降解實(shí)驗(yàn)，是菌株整個纖維素酶系酶活的總體現(xiàn)，代表了纖維素酶的3種酶組分的協(xié)同作用．選取1張新華濾紙，將其剪成同樣大小和質(zhì)量的濾紙條，將濾紙條單獨(dú)滅菌，采用無菌操作將滅菌濾紙轉(zhuǎn)移到濾紙崩解實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基中， 分別接種 200 μL 3菌株菌液于以濾紙條為唯一碳源的 50 mL 濾紙崩解實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基中,在29 ℃和 80 r/min 的條件下輕微振蕩培養(yǎng)，24 h 后取出沖洗拍照，CBS-1菌株對濾紙的崩解能力最強(qiáng)，可以明顯觀察到接種有CBS-1菌株的濾紙邊緣被酶解，而且整個濾紙片明顯分解為糊狀，濾紙變得蓬松，對照組濾紙邊緣和內(nèi)部平整(見圖2)，另外兩株的崩解力較弱．

濾紙失重實(shí)驗(yàn)按照1.2.4方法進(jìn)行后，將接種CBS-1菌株的濾紙和沒有接種菌株的對照濾紙7 000×g 離心，倒上清液，用鹽酸/硝酸的混合液沖洗而消除濾紙片上的吸附菌體，清水洗滌后離心，105 ℃烘干至恒重后稱重，按下面的公式(1)計算失重率．結(jié)果(表1)進(jìn)一步說明，在剛果紅CMC-Na培養(yǎng)平板上水解透明圈最大而且清晰、濾紙崩解能力最大的的CBS-1菌株分泌纖維素酶的能力最強(qiáng)，具有較好的應(yīng)用潛力．

(1)

圖3 菌株發(fā)酵120 h后以稻草粉和以CMC-Na為底物時的CMC酶活性和TFA酶活性(A：稻草為底物時CMC酶活性；B：CMC-Na為底物時CMC酶活性；C：稻草為底物時FPA酶活性；D：CMC-Na為底物時FPA酶活性)

2.2.2 CMC酶活和FPA酶活測定 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)，得到標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度和吸光度的回歸曲線方程：y=3.704 3x- 0.006 1,y為縱坐標(biāo)葡萄糖含量(g/L)，x為橫坐標(biāo)吸光度，根據(jù)吸光度計算葡萄糖的濃度，再根據(jù)葡萄糖的濃度計算CMC酶和FPA酶活性，定義在pH 4.8時 50 ℃水浴恒溫 30 min下每分鐘1 L催化底物水解生成 1 μg 葡萄糖所需的酶量為16.67 nkat．

分別以0.125 mm孔徑稻草粉和CMC-Na為底物，28 ℃～29 ℃ 220 r/min 條件下培養(yǎng) 120 h 后，12 000×g 4 ℃ 離心10 min 收集粗酶液，測定的CMC酶活和FPA酶活見圖3．結(jié)果說明，本實(shí)驗(yàn)篩選到的菌株無論是以稻草粉為底物，還是以CMC-Na為底物，該纖維素菌株產(chǎn)酶活性都很高，其酶活高于目前文獻(xiàn)所報道的CMC酶活和TFA酶活，尤其是120 h 時，以0.125 mm孔徑稻草粉為碳源的CMC酶活為33.6 mkat/L，且生長迅速，說明該菌對農(nóng)作物秸稈的降解具有較大的應(yīng)用價值．

2.3 纖維素降解菌株的鑒定

根據(jù)濾紙崩解與濾紙失重實(shí)驗(yàn)和酶活力測定實(shí)驗(yàn)，菌株CBS-1有強(qiáng)的纖維素降解能力，具有應(yīng)用研究的潛力，因此利用菌落形態(tài)、菌絲與孢子的特性以及ITS序列進(jìn)行了菌株的鑒定．結(jié)果表明菌落密氈狀、蔓延、菌落反面呈淡黃色，氣生菌絲初期為白色有隔菌絲，然后逐漸變?yōu)榈G色，基內(nèi)菌絲為白色；分生孢子梗直立、光滑、無足細(xì)胞，有掃帚狀不對稱分枝，橢圓形淺綠色分生孢子并排以掃帚狀長于最后一節(jié)分生孢子梗分支上，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)多輪生．根據(jù)形態(tài)《真菌鑒定手冊》和中國真菌志(第35卷)，初步鑒定屬于青霉屬．在此基礎(chǔ)上采用引物對ITS1/ITS4擴(kuò)增菌株的18S rDNA，經(jīng)過上海生工測序(圖4)后，將序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)該序列與產(chǎn)黃青霉的同源性大于99%，再構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)，遺傳距離與產(chǎn)黃青霉最近，結(jié)合形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，鑒定該菌株為產(chǎn)黃青霉．

圖4 菌株CBS-1的18S rDNA序列

圖5 菌株CBS-1的基于18S rDNA 序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

本研究使用的分離培養(yǎng)基是將查氏培養(yǎng)基中的蔗糖改成羧甲基纖維素鈉，同時在培養(yǎng)基上直接添加剛果紅，篩選到了一株高產(chǎn)纖維素酶菌株，該方法可初步判定酶活性高低，是一種優(yōu)于傳統(tǒng)的篩選方法．盡管Teather和 Wood指出僅以透明圈大小作為菌株產(chǎn)纖維素酶活大小的唯一定量指標(biāo)不可靠[12]．但作者篩選的CBS-1菌株在透明圈與酶活兩方面皆明顯，濾紙失重率為24.1%，尤其120 h 時，以0.125 mm孔徑稻草粉為碳源的CMC酶活為33.6 mkat/L，且生長迅速，說明該菌株以稻草作為唯一碳源時，具有較好的產(chǎn)纖維素酶活性，而且轉(zhuǎn)化效率高．從產(chǎn)酶的監(jiān)控過程來看,該菌株酶活值基本上呈隨時間推移而上升的趨勢，可能其產(chǎn)酶屬于生長偶聯(lián)型的，具有潛在的開發(fā)應(yīng)用價值．因而，菌株CBS-1是本研究獲得的纖維素酶活力最高的菌株，明顯高于許多已經(jīng)報道的菌株[9,11,13-14].為進(jìn)一步提高纖維素酶活力，本研究室還將對分離的高產(chǎn)纖維素酶菌株CBS-1進(jìn)行人工誘變，以期望獲得更加高產(chǎn)纖維素酶的菌種，實(shí)現(xiàn)纖維素物質(zhì)的高效轉(zhuǎn)化．

作者結(jié)合形態(tài)學(xué)和現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對CBS-1菌株進(jìn)行了鑒定，并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，認(rèn)為該菌株為產(chǎn)黃青霉．這為今后進(jìn)一步優(yōu)化其產(chǎn)酶條件，或?qū)ζ溥M(jìn)行人工誘變提高酶活打下了一定的基礎(chǔ)；還可以利用該優(yōu)良菌株研究混菌發(fā)酵制備高催化活性的纖維素酶，為生物再生能源的開發(fā)應(yīng)用和科學(xué)研究提供參考依據(jù)．

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