李鵬昊,傅迎春,王 婷,部麗娟,謝青季,姚守拙

(湖南師范大學(xué)化學(xué)生物學(xué)及中藥分析教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，化學(xué)化工學(xué)院，中國 長沙 410081)

高效固定酶分子是研制安培型酶電極的關(guān)鍵步驟，而采用導(dǎo)電或絕緣聚合膜基質(zhì)是有效固定酶分子的常用方法[1-6]，其中絕緣聚合膜常能更好地抑制抗壞血酸、尿酸等共存電活性物質(zhì)的干擾[2, 5, 6]．化學(xué)聚合和電化學(xué)聚合法是兩種常用的原位固定酶的方法，前者更易實(shí)現(xiàn)更高的酶負(fù)載量和固定酶活性[5, 6]，而后者更易于精確控制膜厚．我們將化學(xué)聚合和電化學(xué)聚合法相結(jié)合，提出了一種原位化學(xué)預(yù)氧化并電聚合單體的方法，所制酶電極性能優(yōu)異[7]．納米材料及其在分析化學(xué)中的應(yīng)用近年來備受重視，包括納米復(fù)合材料在研制生物傳感器的應(yīng)用[8, 9]．然而，采用簡便的一鍋法制備生物納米復(fù)合物的工作目前并不多見．

本文中，我們基于HAuCl4和鄰氨基酚(oAP)的化學(xué)反應(yīng)及oAP的電聚合反應(yīng)，在葡萄糖氧化酶(GOx)共存條件下，研制了電合成的聚鄰氨基酚(PoAP)-鄰氨基酚寡聚物(oAPO)-金納米顆粒(AuNPs)-GOx復(fù)合物酶膜，用于安培傳感分析葡萄糖，性能優(yōu)異．采用電化學(xué)石英晶體微天平(EQCM)實(shí)時(shí)監(jiān)測了酶電極制備過程．

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

所有電化學(xué)實(shí)驗(yàn)均在CHI660電化學(xué)工作站(CH Instrument Co., USA)上進(jìn)行．EQCM實(shí)驗(yàn)采用HP4395A網(wǎng)絡(luò)/頻譜/阻抗分析儀(Agilent, USA)．采用直徑12.5 mm的AT切9 MHz壓電石英晶體(北京晨晶電子有限公司)，雙面鍍金，實(shí)驗(yàn)中單面觸液．直徑6 mm的金電極為工作電極，參比電極為飽和KCl甘汞電極(SCE)，對電極為碳棒．采用Pico Scan 5型(Agilent，USA)原子力顯微鏡．

GOx(EC 1.1.3.4; Ⅱ型，源自黑曲霉菌，活性均為150 kU·g-1)購自Roche公司 (Japan)，葡萄糖購自上海化學(xué)試劑公司．oAP購自廣東臺(tái)山化工廠．磷酸緩沖溶液 (PBS，pH 7.0) 配比為0.1 mol·L-1K2HPO4/KH2PO4+ 0.1 mol·L-1K2SO4．實(shí)驗(yàn)中使用的所有化學(xué)試劑均為分析純或更高純度．使用的水為Milli-Q超純水(電阻率≥18 MΩ·cm)．

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

金工作電極經(jīng)化學(xué)和電化學(xué)處理．電極表面先滴加濃硫酸和雙氧水的混合液(vH2SO4∶vH2O2=3∶1)清洗，再在0.2 mol·L-1HC1O4水溶液中進(jìn)行電位環(huán)掃(電位區(qū)間0 ～ 1.5 V vs.SCE，掃速30 mV·s-1)，直至循環(huán)伏安曲線重現(xiàn)．

在1 mL含15 mmol·L-1oAP的除氧PBS溶液中，加入1 mg GOx，攪拌溶液，緩慢加入40 μL 10 mmol·L-1HAuCl4(或12 μL 0.1 mmol·L-1K3Fe(CN)6)化學(xué)氧化劑，單體氧化后可得到短鏈寡聚物和少量長鏈聚合物(以下統(tǒng)稱為寡聚物)[7, 10]并包埋AuNPs和GOx，得到oAPO-AuNPs-GOx納米復(fù)合物懸濁液．將處理后的金電極浸入上述懸濁液中，電位環(huán)掃(0 ～ 1.2 V，掃速30 mV·s-1)，得PoAP-oAPO-AuNPs-GOx(或PoAP-oAPO-GOx-K3Fe(CN)6)酶膜．采用EQCM監(jiān)測過程．電極水洗后，存于PBS緩沖液中備用．基于常規(guī)電聚合方法的酶膜(PoAP-GOx)制備類似，但無HAuCl4或K3Fe(CN)6．所制酶電極儲(chǔ)存于PBS中備用(4 ℃冰箱)．

酶電極檢測采用三電極系統(tǒng)，將酶電極置于10 mL pH 7.0的PBS緩沖液中，在0.7 VvsSCE恒電位下，檢測葡萄糖溶液加入前后的穩(wěn)態(tài)陽極電流變化(對應(yīng)于酶生H2O2的電氧化)．所有實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行．

2 結(jié)果與討論

2.1 酶電極的制備及表征

圖1為oAPO-AuNPs-GOx懸濁液的電聚合響應(yīng)圖．可見，過量的oAP單體在0.04 V開始氧化，而在0.2 V出現(xiàn)了頻率的下降，表明oAPO-AuNPs-GOx和PoAP在電極表面開始共沉積．因?yàn)镻oAP膜的絕緣性，電流和頻率響應(yīng)逐圈顯著下降．三圈后，總頻率下降約3800 Hz，而動(dòng)態(tài)電阻上升了約25 Ω，-Δf0/ΔR1=152 Hz·Ω-1，明顯大于粘密度效應(yīng)特征值10 Hz·Ω-1[2, 11-13]，表明該聚合膜高度剛性．圖2為酶膜的原子力顯微鏡(AFM)圖，可見膜粗糙多孔，顆粒直徑約90 nm．

我們對酶電極制備及檢測條件進(jìn)行了優(yōu)化(圖略)．當(dāng)膜厚為3 800 Hz時(shí)，酶電極的電流響應(yīng)最大．因?qū)嶒?yàn)條件下oAP的最大可溶解濃度約15 mmol·L-1，故采用此濃度實(shí)驗(yàn)．實(shí)驗(yàn)中采用0.4 mmol·L-1的HAuCl4濃度，因?yàn)镠AuCl4濃度過低，不利于化學(xué)聚合反應(yīng)的發(fā)生和酶的包埋，過高則易產(chǎn)生納米金和聚合物沉淀．此時(shí)HAuCl4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.016%，而Frens法所用HAuCl4質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%基本一致[14]．實(shí)驗(yàn)中選擇GOx濃度為1 g·L-1，過低會(huì)影響酶的固定效率，過高則抑制聚合反應(yīng)．選擇酶電極的工作電位為0.7 V和檢測溶液pH值為7.0，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果[2, 3, 7]一致．

圖1 在含15 mmol·L-1 oAP, 1 g·L-1 GOx和0.4 mmol·L-1 HAuCl4的PBS溶液中電流、頻率和阻抗隨電位環(huán)掃的響應(yīng)曲線，掃速：10 mV·s-1

圖2 PoAP-oAPO-AuNPs-GOx修飾電極的AFM圖

2.2 酶電極性能

在最優(yōu)條件下，分別制備了PoAP-GOx、PoAP-oAPO-GOx-K3Fe(CN)6以及PoAP-oAPO-AuNPs-GOx修飾電極并考察了酶電極對葡萄糖的響應(yīng)性能(圖3及表1)．可見，PoAP-oAPO-AuNPs-GOx電極的靈敏度最高，分別是PoAP-oAPO-GOx-K3Fe(CN)6和PoAP-GOx電極的1.7倍和4.5倍，優(yōu)于很多文獻(xiàn)報(bào)道的第一代GOx生物傳感器[1-3, 11, 13]．PoAP-oAPO-AuNPs-GOx酶電極的檢測下限比其余兩酶電極降低了一個(gè)數(shù)量級．PoAP-oAPO-AuNPs-GOx酶電極的優(yōu)異性能可歸因于：(1)固定酶的高負(fù)載量和高活性；(2)納米金的導(dǎo)電能力和催化特性．

圖3 PoAP-GOx (1), PoAP-oAPO-GOx-K3Fe(CN)6 (2)和PoAP-oAPO-AuNPs-GOx (3)修飾電極對濃度遞增葡萄糖的電流響應(yīng)(A)及工作曲線(B)．插圖為線性響應(yīng)區(qū)間的工作曲線

電 極靈敏度/(μA mmol·L-1·cm-2)線性范圍/(mmol·L-1)檢測限/(μmol·L-1)PoAP-GOx9.80.002～1.609.4PoAP-oAPO-GOx-K3Fe(CN)626.40.005～1.531.5PoAP-oAPO-AuNPs-GOx44.00.005～1.530.3

考察了上述三種酶電極的抗干擾性能．0.1 mmol·L-1抗壞血酸和尿酸的加入對2 mmol·L-1葡萄糖的電流響應(yīng)基本上無干擾(低于5%)．也考察了所制PoAP-oAPO-AuNPs-GOx酶電極的操作穩(wěn)定性及儲(chǔ)存穩(wěn)定性．連續(xù)10次測試2 mmol·L-1葡萄糖，電流響應(yīng)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在5%以內(nèi)；連續(xù)50 d對酶電極進(jìn)行了檢測，2 mmol·L-1葡萄糖的電流響應(yīng)值保持在其最初響應(yīng)的80%以上，表明該電極操作和儲(chǔ)存穩(wěn)定性俱佳．

3 結(jié)論

本文所提出的納米復(fù)合物制備方法可高負(fù)載量和高活性地包埋酶，酶電極制備方法簡便、高效，酶電極性能優(yōu)異，可望在生物傳感、生物材料和生物催化等領(lǐng)域進(jìn)一步應(yīng)用．

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