劉冰妮， 劉 默， 劉登科， 劉 巍， 祁浩飛

(1． 天津藥物研究院 天津市分子設(shè)計(jì)與新藥發(fā)現(xiàn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193；2． 天津工業(yè)大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300160)

異噁唑啉化合物因具有廣泛的生物活性，如抗菌、抗炎、抗腫瘤[1～3]等而成為重要的醫(yī)藥中間體及先導(dǎo)化合物。對(duì)異噁唑啉類化合物的結(jié)構(gòu)改造一直是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[4]。

為尋找抗腫瘤藥物提供篩選目標(biāo)，本文在文獻(xiàn)[1]方法的基礎(chǔ)上，以3，4-二氟苯甲醛為起始原料，依次合成了3，4-二氟苯肟(1)， 3，4-二氟苯肟氯化物(2)，N-5-(乙酰胺甲基)-3-(3，4-二氟苯基)異噁唑啉(3)和N-【{3-[3-氟-4-(1-哌嗪基)苯基]-4，5-二氫-5-異噁唑}甲基】乙酰胺(4)等重要中間體。4與取代苯磺酰氯(5a～5f)經(jīng)親核取代反應(yīng)合成了6個(gè)新型的異噁唑啉類化合物(6a～6f， Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和MS表征。采用MTT法測(cè)試了6a～6f對(duì)骨肉瘤細(xì)胞(U2OS)和結(jié)腸癌細(xì)胞(HT-29)的抑菌活性，結(jié)果表明，6a～6f的IC50值均小于5-Fu,表明其具有較好的抑制U2OS和HT-29的作用，特別是6a,6c和6e表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤細(xì)胞的活性。

CompabcdefAr - HO2C- F3C- F- Cl- O2N-

Scheme1

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

Bruker AV400型核磁共振儀(DMSO為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；LCQ AD MAX型質(zhì)譜儀；Sunrise型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀。

3，4-二氟苯甲醛，工業(yè)品；N-烯丙基乙酰胺，自制；其余所用試劑均為分析純；5-Fu注射液，天津金耀氨基酸有限公司；MTT, Amresco公司；DMEM培養(yǎng)基，Gibco公司；U2OS和HT-29，中科院上海細(xì)胞研究所。

1．2 合成

(1) 4的合成

在反應(yīng)瓶中加入3,4-二氟苯甲醛20 g(140 mmol),鹽酸羥胺12.8 g(180 mmol)和無(wú)水乙醇50 mL,攪拌使其溶解;加蒸餾水2 mL,緩慢滴加53%NaOH溶液25 mL,滴畢，于室溫反應(yīng)4 h。傾入冰水中析晶，過(guò)濾，濾餅干燥得白色固體1 18．5 g。

在反應(yīng)瓶中加入1 18 g(110 mmol)的二氯甲烷(180 mL)溶液,攪拌下分批加入NCS 16.8 g(120 mmol)，加畢，回流反應(yīng)2 h(TLC檢測(cè))。自然冷卻至室溫，加入N-烯丙基乙酰胺11 g(110 mmol)，冰水浴冷卻至0 ℃，滴加三乙胺，滴畢，反應(yīng)至終點(diǎn)(TLC檢測(cè))。用飽和食鹽水洗滌，無(wú)水Na2SO4干燥，減壓蒸除溶劑，殘余物干燥得淡黃色固體3 12 g,收率42.9%(以1計(jì)),m.p．138.6 ℃～139.2 ℃；1H NMRδ: 1.80(s, 3H), 3.05～3.48(m, 4H), 4.71～4.77(m, 1H), 7.47～7.73(m, 3H), 8.09～8.12(t,J=5.6 Hz, 1H)。

在反應(yīng)瓶中加入3 12 g(47 mmol),無(wú)水哌嗪40.6 g(470 mmol)和碳酸鉀8.4 g(60 mmol)，攪拌下于100 ℃～140 ℃反應(yīng)5 h(TLC檢測(cè))。降至室溫，加入適量二氯甲烷及蒸餾水?dāng)嚢?，分液，有機(jī)層用水洗滌，無(wú)水Na2SO4干燥；減壓蒸除溶劑，殘余物干燥得白色固體4 14.1 g,收率93%， m.p.160.5 ℃～161.3 ℃；1H NMRδ: 1.79(s, 3H), 3.03(m, 1H), 3.10～3.19(m, 8H), 3.22(t,J=5.6 Hz, 2H), 3.40(m, 1H), 4.66～4.70(m, 1H), 7.33～7.54(m, 3H), 8.06～8.09(t,J=5.6 Hz, 1H)。

(2) 6的合成(以6a為例)

在反應(yīng)瓶中加入4 2 g(6 mmol)的二氯甲烷(50 mL)溶液，攪拌下加入碳酸鉀1.3 g(9 mmol)，冰水浴冷卻至10 ℃，緩慢滴加對(duì)甲苯磺酰氯(5a)1.18 g(6 mol)的二氯甲烷(15 mL)溶液,滴畢，于室溫反應(yīng)2 h～3 h(TLC檢測(cè))。用蒸餾水洗滌，無(wú)水Na2SO4干燥，減壓蒸除部分溶劑后于低溫放置析晶，過(guò)濾，濾餅干燥得白色固體6a。用類似的方法合成白色固體6b～6f。

6a： 收率63%，純度99.9%(HPLC，下同)，m.p.182.1 ℃～182.5 ℃；1H NMRδ: 1.79(s, 3H), 2.41(s, 3H), 3.01～3.40(m, 8H), 4.68～4.69(m, 1H), 7.03～7.66(m, 7H), 8.08(t,J=5.6 Hz, 1H)； MSm/z: 475.2{[M+H]+}。

6b： 收率49%，純度99.1%， m.p.195.1 ℃～196.7 ℃；1H NMRδ: 1.81(s, 3H), 3.01～3.40(m, 12H), 4.68(m, 1H), 7.02～8.13(m, 7H), 8.20(t,J=5.2 Hz, 1H)； MSm/z: 505.2{[M+H]+}。

6c： 收率61%，純度99.5%， m.p.155.9 ℃～156.4 ℃；1H NMRδ: 1.80(s, 3H), 3.02～3.41(m, 12H), 4.67(m, 1H), 7.05～7.99(m, 7H), 8.10(t,J=5.2 Hz,1H)； MSm/z: 529.3{[M+H]+}。

6d： 收率78%，純度99.7%， m.p.141.6 ℃～142.3 ℃；1H NMRδ: 1.80(s, 3H), 3.03～3.42(m, 12H), 4.68(m, 1H)， 7.05～7.83(m, 7H), 8.08(t,J=5.2 Hz, 1H)； MSm/z: 479.1{[M+H]+}。

6e： 收率56%，純度99.2%， m.p.206.2 ℃～207.1 ℃；1H NMRδ: 1.80(s,3H), 3.02～3.12(m, 12H), 4.67(m, 1H)， 6.99～7.64(m, 7H), 8.09(t,J=6.0 Hz, 1H)； MSm/z: 563.2{[M+H]+}。

6f： 收率57%，純度99.4%， m.p.175.9 ℃～176.7 ℃；1H NMRδ: 1.79(s, 3H), 3.01～3.40(m, 8H), 4.66(m, 1H), 7.07～7.54(m, 7H), 8.06(t,J=5.6 Hz, 1H)； MSm/z: 506.5{[M+H]+}。

1．3 抗腫瘤活性測(cè)試

采用MTT法測(cè)試6對(duì)U2OS和HT-29的體外藥效。以5-Fu為陽(yáng)性對(duì)照藥,6用DMSO助溶，再用無(wú)血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋到所需濃度待用。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞以(6～10)×104個(gè)·mL-1的濃度接種于96孔板，每孔90 μL。在37 ℃, 100%相對(duì)濕度, 5%CO2和95%空氣的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。每孔加10 μL藥液，藥液濃度為40．0 μg·mL-1, 20．0 μg·mL-1, 10．0 μg·mL-1, 5．0 μg·mL-1和2.5 μg·mL-1。各藥物各濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，并設(shè)空白組(不加細(xì)胞)和陰性對(duì)照組(加等濃度DMSO)，藥物作用24 h后加5 mg·mL-1MTT溶液10 μL/孔，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后加100 μL DMSO/孔，置酶標(biāo)儀上于492 nm測(cè)OD值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率{抑制率/%=[1-(OD藥液-OD空白)/(OD對(duì)照-OD空白)]×100%}，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，以直線回歸方法計(jì)算IC50值。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

在2的合成中，要控制好NCS分批加入的量和速度，以便控制反應(yīng)液的溫度。溫度上升過(guò)快，易使溶劑劇烈沸騰，發(fā)生溢出。

合成3時(shí)反應(yīng)的副產(chǎn)物較多，產(chǎn)率較低。本文對(duì)其工藝進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)溫度是最大的影響因素，并確定0 ℃和n(2) ∶n(N-烯丙基乙酰胺)=1 ∶1為最佳反應(yīng)條件。

在4的合成中，無(wú)水哌嗪既是反應(yīng)物料，又是溶劑，需過(guò)量加入，最佳投料比為：n(3) ∶n(無(wú)水哌嗪)=1 ∶10。

合成6時(shí)，考慮到5的活性較強(qiáng)，改變加料方式，采用緩慢滴加5的二氯甲烷溶液，避免了副反應(yīng)的發(fā)生。后處理時(shí)保留部分溶劑使產(chǎn)物以結(jié)晶析出方式得到，純度達(dá)99%以上。

2.2 抗腫瘤活性

6的抗腫瘤活性結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，其IC50值均小于陽(yáng)性對(duì)照藥物5-Fu，表明6a～6f對(duì)U2OS和HT-29均有較好的抑制作用，特別是6a,6c和6e表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制U2OS和HT-29腫瘤細(xì)胞的活性。

表1 6的抗腫瘤活性Table 1 Anti-tumor activities of 6

[1] Barbachyn M R, Morris J, Wishka D G,etal． Substituted aminophenyl isoxazoline derivatives useful as antimicrobials[P].WO 9 941 244,1999．

[2] Cohan V L, Kleinman E F. Isoxazoline comounds as inhibitors of TNF release[P].US 6 114 367,2000.

[3] Li Q, Woods K W, Claibome A,etal. Synthesis and biological evaluation of 2-indolyloxazolines as a new class of tubulin polymerization inhibitors.Discovery of A-289099 as orally active antitumor agent[J].Bioorg Med Chem Lett,2002,12(3):465-469.

[4] Rakesh Sun D, Lee R B, Tangallapally R,etal. Synthesis,optimization and structure-activity relationships of 3,5-disubstituted isoxazolines as new anti-tuberculosis agents[J].Eur J Med Chem,2009,44(2):460-472.